ChIP-seq等揭示人畜共患寄生虫弓形虫的蛋白质乳酸化和代谢调

弓形虫（Toxoplasma gondii）是弓形虫病（toxoplasmosis）广泛传播的寄生虫病的病原体之一，但其生物学特性仍然知之甚少。乳酸（Lactate）作为葡萄糖代谢的产物，不仅在包括弓形虫在内的多种生物体中作为能量来源，还是一种参与基因激活和蛋白质功能的调控分子。赖氨酸乳酸化（Lysine lactylation, Kla）是一种与染色质重塑相关的翻译后修饰（Posttranslational modifications，PTM），然而在弓形虫中，组蛋白和非组蛋白的Kla尚未被研究。

2022年10月7日，沈阳农业大学畜牧兽医学院尹德琦博士等为第一作者、沈阳农业大学陈启军教授为通讯作者以“Protein Lactylation and Metabolic Regulation of the Zoonotic Parasite Toxoplasma gondii”为题在《Genomics, Proteomics & Bioinformatics》杂志发表研究论文，文章通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）等实验首次对弓形虫乳酸进行了全面分析，并对Kla的调控潜力进行了深入剖析，为阐明弓形虫生物学特性和寻找新的杀虫靶标开辟了新的途径。

标题：Protein Lactylation and Metabolic Regulation of the Zoonotic Parasite Toxoplasma gondii（人畜共患寄生虫弓形虫的蛋白质乳酸化和代谢调控）

时间：2022-10-7

期刊：Genomics, Proteomics & Bioinformatics

影响因子：IF 9.5

技术平台：ChIP-seq等

研究摘要：

为分析乳酸化在弓形虫寄生虫中的发生率和功能，研究人员绘制了速殖子增殖细胞的乳酸化组图谱，并在弓形虫RH株系中955种蛋白质上鉴定出1964个乳酸化位点。乳酸化蛋白质分布在多个亚细胞区域，并与多种生物过程密切相关，包括mRNA剪接、糖酵解、氨酰基-tRNA生物合成、RNA转运以及许多信号通路。研究人员还使用特异性乳酸化抗体进行了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析，分析结果表明组蛋白H4K12la和H3K14la在基于微管运动和细胞侵袭相关的弓形虫启动子和外显子区域富集。进一步验证了组蛋白去乙酰化酶TgHDACs 2、3和4的去乳酸化活性。同时，研究还表明使用抗组蛋白乙酰转移酶（TgMYST-A）抗体处理显著降低了弓形体中的蛋白质乳酸化。本研究提供了首个全球乳酸化蛋白质组数据集，并为进一步解析弓形虫的功能生物学提供了基础。

研究结果

（1）弓形虫RH蛋白质组中Kla的鉴定

图1：western blotting、免疫荧光分析（IFA）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析揭示弓形虫中广泛存在乳酸化。 A. 用抗乳糜蛋白酶抗体（anti-lactyllysine antibody）对速殖子裂解物（20μg）的SDS-PAGE和western blotting分析。 B. 弓形虫RH速殖子与抗乳糜蛋白酶抗体的IFA分析（绿色）。阴性对照抗体是正常的兔IgG。细胞核用DAPI（蓝色）染色。 C. 使用抗乳糜蛋白酶抗体的弓形虫ME49的速殖子IFA分析（绿色）。阴性对照抗体是正常的兔IgG。细胞核用DAPI（蓝色）染色。 D. 赖氨酸乳酸化的LC-MS/MS数据。 E. 维恩图显示了从三次重复中获得的乳酸化蛋白质重叠部分。 F. 维恩图显示了从三次重复中获得的乳酸化位点重叠部分。Kla，赖氨酸乳酸化；LC-MS/MS，液相色谱-串联质谱法；IFA，免疫荧光分析；T.gondii，弓形虫；SDS-PAGE，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；IgG，免疫球蛋白G；DAPI，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚。

（2）乳酸化蛋白广泛分布于弓形虫的多个亚细胞区室中

图2：乳酸化蛋白分布在多个亚细胞区室中，并参与多种生物功能。 A. 已鉴定的乳酸化蛋白的亚细胞分布。 B. 乳酸化蛋白的KEGG富集分析（Fisher精确检验，P<0.05）。 C. 使用KOG数据库进行乳酸化蛋白的功能分类。横轴表示KOG类别，纵轴表示蛋白数量。 使D. 用Motif-x生成由靶向赖氨酸残基周围的20个残基组成的乳酸化位点的概率序列motif。每个字母的大小对应于该氨基酸残基出现在该位点的频率。 E. 热图显示乳酸化赖氨酸周围氨基酸出现的高（红色）或低（绿色）频率。红框表示在修饰位点附近出现频率更高的氨基酸，绿框表示修饰位点附近的氨基酸频率较低。KEGG，京都基因和基因组百科全书；DC，差分；KOG，真核生物同源基因组。

（3）组蛋白乳酸化在弓形虫中得到深刻鉴定

图3：多个PTM发生在相同的组蛋白位点。 这些数字表示组蛋白上修饰位点的具体位置。不同颜色的椭圆表示不同类型的PTM。不同颜色的框表示不同的域。水平浅蓝色线描述了介导PPI或生物过程的区域（氨基酸）的特征（来自通用蛋白质资源数据库的特定信息)。PTM，蛋白翻译修饰；PPI，蛋白-蛋白互作。 图4：弓形虫H4K12和H3K14被鉴定为组蛋白乳酸化位点。 A. 组蛋白H4K12la和H3K14la的western blotting分析。 B. 组蛋白H4K12la和H3K14la在寄生虫细胞内和细胞外阶段的间接IFA分析。兔IgG作为阴性对照。 C-D. 弓形虫的组蛋白H4K12la和H3K14la的MS/MS谱。a和b离子是指肽的N-末端部分，y离子是指多肽的C-末端部分。 E. 组蛋白乳酸化位点（H4K12la和H3K14la）在染色体上的结合区分布circos图。最外圈显示染色体，内圈显示每个样本的分布趋势。数据代表三个生物学重复。 F. H4K12la和H3K14la peaks在全基因组中的重叠分布。圈条长度表示富集程度，圆圈内的位置对应于peaks位置。ChIP-seq，染色质免疫沉淀测序。

（4）磷酸果糖激酶II（PFKII）是乳酸化的重要调控因子

图5：抗TgPFKII抗体降低了蛋白质乳酸化。 A. 通过western blotting验证纯化的重组蛋白TgPFKII。 B. 弓形虫RH和ME49中TgPFKII表达水平（131kDa）的western blotting分析。β-肌动蛋白用于归一化。数据以三个生物重复的平均值±标准差表示（*，P<0.05；**，P<0.01；Student t检验）。 C. 用抗PFKII抗体免疫沉淀源自弓形虫RH和ME49的可溶性蛋白，并用抗PFKII抗体检测沉淀的PFKII蛋白（箭头指示）。 D. 通过IFA分析不同浓度的阴性IgG（小鼠IgG）对蛋白质乳酸化（绿色）没有影响。 E. 抗TgPFKII抗体以浓度依赖性方式抑制蛋白质乳酸化（绿色）。 F. 分别对用抗PFKII抗体和阴性对照抗体处理的组进行免疫荧光强度统计分析。采用Student t检验进行统计学显著性分析。所有数据均显示为平均值±标准差（N>10）。***，与对照组相比P＜0.001。 G. western blotting检测不同浓度的抗PFKII抗体对弓形虫RH乳酸化水平的影响。β-肌动蛋白用于归一化。IP，免疫沉淀；PFKII，磷酸果糖激酶。  

（5）组蛋白去乙酰化酶（HDAC）和乙酰转移酶抗体对其酶活性产生显著影响

图6：与蛋白质乳酸化相关的TgHDAC2、TgHDAC3、TgHDLC4和TgMYST-A的功能初步分析。 A. TgHDAC2、TgHDAC3、TgHDLC4和TgMYST-A的序列特征。 B. 特异性抗体对TgHDAC2（71 kDa）、TgHDAC3（53 kDa）、TgHDAC4（101 kDa）和TgMYST-A（56 kDa）的表达进行western blotting分析。 C. TgHDAC2、TgHDAC3、TgHDAC4和TgMYST-A的间接IFA分析（共定位）。 D. 特异性抗体对PTM影响的流程图。 E. 抗TgHDAC2、抗TgHDLAC3、抗Tg HDAC4和抗TgMYST-A抗体对弓形虫的乳酸化、2-羟基异丁酰化、巴豆酰化和乙酰化的调控。用箭头指示修饰水平变化的蛋白。β-肌动蛋白用于归一化。 HDAC2、HADC3和HDAC4是组蛋白去乙酰化酶；MYST-A是一种组蛋白赖氨酸乙酰转移酶。 

研究小结

研究总结了TF相关蛋白、RNA聚合酶相关蛋白、DBP和RBP中的乳酸化蛋白，发现它们与一系列过程有关，包括基因转录、RNA剪接、蛋白质翻译和加工（图7）。在弓形虫中总共鉴定出23个TF、7个RNA聚合酶、6个DBP和27个RBP，分别具有49、8、8和62个Kla位点。

总之，本研究建立了第一个人畜共患寄生虫弓形虫蛋白质乳酸化的综合图谱，并揭示了乳酸化在寄生虫的各种生物过程中深刻调控与能量代谢和基因激活相关的蛋白质。这些数据为开发抗寄生虫药物提供了新的途径。

图7：乳酸化参与基因调控示意图。 示意图显示乳酸化蛋白，如转录因子蛋白、RNA聚合酶相关蛋白、DBP和RBP，参与转录和翻译调控过程。蓝框内的字体表明，乳酸化RBPs可能在不同细胞的各种转录后过程中发挥广泛作用。在细胞核中将前体mRNA剪接成成熟mRNA的过程中，乳酸化的RBPs和剪接因子是主要的参与者。此外，乳酸化的RBPs可以帮助mRNA在核糖体中翻译成蛋白质，一些RBPs可能被泛素-蛋白酶体系统降解。DBP，DNA结合蛋白；UPS，泛素-蛋白酶体系统；RBP、RNA结合蛋白。

参考文献：

YinD, Jiang N, Cheng C, Sang X, Feng Y, Chen R, Chen Q. Protein Lactylation andMetabolic Regulation of the Zoonotic Parasite Toxoplasma gondii. GenomicsProteomics Bioinformatics. 2022 Oct 7. pii: S1672-0229(22)00126-7. doi:10.1016/j.gpb.2022.09.010. PubMed PMID: 36216028.