Hello，大家好呀！我今天想和大家分享一篇蛮有意思的文献，于2020年11月13日发表于Scientific Reports ，题目为“Characterisation of CD4+ T-cell subtypes using single cell RNA sequencing and the impact of cell number and sequencing depth”，文章探讨了测序深度和细胞数量对准确鉴定CD4 + T细胞亚型的影响，以及静息或刺激条件下对细胞分型的影响。更多生信人原创文章见：生信人。
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背景介绍
1、CD4+T细胞的分型多种多样，scRNA-seq（如Drop-Seq或10xGenomics）可以用于研究细胞间的异质性，探索细胞分化及与健康或疾病相关的细胞亚型；
2、设计scRNA-seq实验的两个关键考虑因素是读取深度和细胞数量。尽管已经证明，对于Fluidigm微流控平台，每个细胞50,000个reads足以对细胞进行分型，但每个细胞需要500,000至一百万个reads才能检测更广泛的基因表达并量化细微的表达变化；
3、当前基于液滴系统的建议范围是每个细胞20,000-50,000个reads，部分原因是这些方法依赖于3'mRNA-seq分析，而不是其他基于非液滴的技术通常采用的全长分析。尽管有此建议，仍需要根据细胞类型和实验要求调整该深度；
4、考虑细胞数量时，没有公认的建议，因为这取决于实验要求和样品异质性。样本越异质，就需要越多的细胞来捕获技术噪声下的真实变异性。例如，在对约2700个外周血单核细胞（PMBC）的数据集进行的分析中，可以轻松识别出8个主要细胞群，包括CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，B细胞和单核细胞。但是，通过将细胞数增加到约68,000个，可以将CD4 + T细胞进一步分解为代表幼稚，记忆和调节性CD4 + T细胞。
方法及分析流程
1. Sample：通过对PBMC进行流式分析，对CD4+细胞进行提取，并且按照1：1进行刺激；
2. Single cell RNA-seq：Chromium Single Cell 3′ Library & Gel Bead v2 kit，Seurat
3. 参比：GRCh38.p10；
4. QC：removed cells expressing less than 200 genes and genes that were expressed in less than 3 cells；
5. 提取Reads不同深度子集：为了研究不同测序深度对细胞分群的影响，对不同测序深度子集进行提取；
6. 细胞数量不同子集：通过随机采样，提取不同的细胞数量进行后续分析；
7. 评估细胞分群准确性：随机森林分类器。
结果分析
研究人员回收了5586个未受刺激的细胞和4621个受刺激的细胞，每个细胞的平均reads数为260,849和333,333。两种样品的测序饱和率均达到96.5％。然而，尽管这导致检测到的基因总数相似，但在不同的reads深度中，受刺激的样品中每个细胞的中位基因多出30％（1443 vs 1090），这可能是由于刺激后的转录激活所致。此外，与受刺激的样本相比，未受刺激的样本中所包含的劣质细胞或者多重细胞会更多（8.8％比4.8％）。图一为在不同条件下的细胞分群。
表一 不同条件下的数据QC
图一：不同条件下的细胞样本进行分群
结果一：细胞质量与Reads深度无关；
对不同细胞reads深度的分析表明，测序饱和度在开始达到平稳状态后迅速上升到大约90％（图2a）。这相当于每个细胞的reads深度约为70000-90000。受激样品显示出更高的基因总数，表明受激样品具有更高的转录活性（图2b– d）。QC之前和之后的QC细胞数量在所有reads深度上都保持稳定（图2e，f），这表明即使在进行质量控制后，识别劣质细胞的能力或检测到基因的数量也与reads深度无关。
图二：不同条件下的测序参数
结果二：未受刺激的细胞分群更容易受测序深度的影响；
通过对不同测序深度的数据集进行分群聚类发现，受刺激的样品可以进行更好的细胞分群，此外，受刺激的样品聚类分群的结果更为一致，甚至在每个细胞50000 reads的情况下。
图三：不同测序深度下的细胞分群
在评估细胞的准确性上，发现在不同的测序深度下，未受刺激的样本细胞分型准确性较低。未受刺激条件下，每个细胞65,000个reads下的准确度为82.6%，而受刺激情况下的准确度为91.3%(Fig. 4a,b)。
图四：不同条件数据集下细胞分群的准确性
图五：不同测序深度下细胞分群的准确性
结果四：细胞数量比测序深度更重要
与测序深度的影响相对较小相比，细胞数对未刺激和刺激的样品都有更深远的影响（图4c，d）。对于未刺激且深度高的样品，2500个细胞的分群准确度迅速降至80％以下，500个细胞的准确度降至60％以下。生信人同样，由于受刺激样品的细胞数较少，准确性也受到影响，3500个细胞减少到90％以下，1000个细胞减少到70％以下，500个细胞减少到60％以下。此外，与测序深度相比，细胞采样的复制变异性也更高，并且通常在较低的细胞数时这种变异性会增加。
图六：准确度的中位数与测序深度和细胞数的关系
结果五：细胞类型在受激细胞中更为明显
从图1中可以看出，细胞的测序深度对细胞分群的影响并不大，并且再受刺激的细胞中的细胞分型更为明显，基因差异表达更为突出。
总结
（1） 在未受刺激的细胞中可以进行准确的细胞分析，测序深度为每个细胞60000-70000 reads;
（2） 受刺激的细胞的细胞分类准确性更高；
（3） 细胞数量对于细胞分群具有深远的影响，至少需要大约2500个细胞才能进行准确分类。
参考文献
Ding, J., Smith, S.L., Orozco, G. et al. Characterisation of CD4+ T-cell subtypes using single cell RNA sequencing and the impact of cell number and sequencing depth. Sci Rep 10, 19825 (2020).
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