2022-07-08

Cancer Cell 丨全基因组筛选发现T细胞耗竭调节因子（2）

原创 珍奇 图灵基因 2022-07-08 09:56 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学机制

撰文：珍奇

IF：31.743

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亮点：

在本研究中，体外T细胞耗竭试验实现了全基因组CRISPR-Cas9筛选，结果显示体外和体内基因筛查在cBAF和INO80复合体亚基上趋于一致；Arid1a-sgRNA T细胞可改善肿瘤控制并增强人类T细胞的持久性；Arid1a是获得末端耗竭的表观遗传状态的必要条件。

T细胞耗竭限制了抗肿瘤免疫能力，但目前人们对这一过程的分子决定因素仍不甚了解。2022年6月23日，《Cancer Cell》杂志上发表了一篇名为“Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence”的研究性论文。该研究利用慢性刺激试验对全基因组进行了CRISPR-Cas9筛选，发现了T细胞耗竭的调节因素，确定了表观遗传因素的富集。他们提供了一个T细胞耗竭的遗传调节因子图谱，并证明调控表观遗传状态可以改善癌症免疫治疗中的T细胞反应。

体外慢性刺激试验再现了终端T细胞耗竭的表观遗传程序

为了开发一种可用于全基因组CRISPR-Cas9筛选T细胞耗竭的检测方法，他们改编了先前的方法，使用抗CD3抗体来强制T细胞共受体CD3的聚集，从而以独立于抗原的方式诱导慢性TCR信号传导。与体内实验相比，该模型分离了T细胞耗竭的核心决定因素——通过TCR复合体的慢性刺激，消除了T细胞的定位和贩运效应，以及肿瘤微环境（TME）中的免疫增强因素。与急性刺激的细胞相比，慢性刺激的T细胞在用乙酸苯丙醇肉豆蔻酯和离子霉素（PMA/IO）重新刺激后，表现出分泌干扰素g（IFN-g）和肿瘤坏死因子a（TNF-a）的缺陷，以及在体外和体内杀伤肿瘤的缺陷。接下来，他们研究了体外耗竭试验是否再现了体内T细胞耗竭的表观遗传特征。在慢性刺激过程中，他们用测序法（ATAC-seq）对转座酶可及染色质进行了检测，并分析了染色质可及性概况。结果表明，体外T细胞耗竭试验显示了体内T细胞耗竭的标志性功能和基因组特征。

图 1. 体外慢性抗原刺激试验概括了 T 细胞衰竭的表观遗传特征

全基因组CRISPR筛选确定T细胞耗竭的遗传调节因子

随后，他们调整了体外耗竭试验使其与CRISPR筛选兼容。他们从Rosa26-Cas9基因敲除的小鼠中分离出CD8+T细胞，用含有90,230个sgRNAs的全基因组逆转录病毒sgRNA库转导细胞，在第4天将细胞分成急性（IL-2）和慢性（抗CD3和IL-2）刺激条件，并在第10天进行测序。他们首先分析了CD3受体亚基（Cd3e，Cd3d，Cd3g，Cd247）的富集情况，并观察到在两个复制中针对这些基因的引导物都有强大的富集。合并复制的结果是每个基因的全部Z评分和排名，并通过比较从另外两种CRISPR sgRNA富集分析方法和两种正常化策略获得的筛选命中率来验证这种分析方法。

除了Cd3e、Cd3d和Cd3g外，筛选中富集度最高的基因包括TCR信号通路的其他已知成分，如Zap70、Lcp2、Lat和Lck，以及细胞粘附和整合素相关基因Fermt3、Tln1、Itgav和Itgb3。对耗竭的前100个阳性调节因子的基因本体论（GO term）分析证实，“TCR信号通路“被高度富集。令人惊讶的是，除了TCR相关的GO term外，其他都与表观遗传学有关，包括 "染色质重塑"和 "核糖体分解”。体外全基因组CRISPR-Cas9耗竭筛选提供了一个全面的遗传因素目录，这些因素支配着慢性抗原诱导的T细胞耗竭过程，并确定了染色质重塑因素作为改善T细胞持久性的潜在目标。

染色质重塑因子限制T细胞在体外和体内的持久性

接下来，他们将慢性与急性基因富集进行了比较，衡量了每个基因敲除相对于初始情况的优势或劣势。与输入相比，大多数基因在急性刺激中显示出相似或减少的富集，从而能够识别出专门改善T细胞在慢性抗原存在下的持久性，而不是一般的T细胞增殖，并在急性刺激后保持增殖能力的sgRNAs。随后他们在两个小鼠肿瘤模型中筛选了sgRNA迷你库。在两种肿瘤模型中，Arid1a、Itk、Smarcd2、B4galnt1、Gata3、Gpr137c、Trp53和Vstm4在肿瘤和脾脏中高度富集。在Cytoscape网络的背景下观察每个基因的肿瘤富集情况，发现许多体内的阳性基因是表观遗传因子，包括INO80复合物（Ino80c和Actr5）和BAF复合物的亚单位。这些结果验证了全基因组筛选，确定了仅在慢性抗原刺激的情况下改善T细胞持久性的扰动，而不是改善一般T细胞的健康状况，并由此对BAF和INO80复合物展开进一步研究。

调整cBAF活性可增强T细胞的持久性并改善肿瘤控制

他们接下来验证了Arid1a-sgRNA细胞的持久性优势，使用细胞竞争试验并用单一靶向对照（CTRL1）sgRNA或带有不同荧光报告剂的Arid1a靶向sgRNA转导细胞，混合后放入体外慢性刺激试验或体内MC-38肿瘤模型。最后，他们评估了观察到的Arid1a-sgRNA细胞的持久性增强是否导致体内抗肿瘤反应的改善。第15天，与转移对照细胞相比，转移Arid1a-sgRNA细胞明显改善了肿瘤清除率。重要的是，与接受CTRL1 T细胞的小鼠相比，接受Arid1a-sgRNA T细胞的小鼠生存期明显延长。

为了更深入地了解BAF复合体因子在T细胞耗竭中的作用，他们在B16和MC-38肿瘤模型中针对29个SWI/SNF复合体亚基基因中的每一个进行了额外的CRISPR小库筛选，并在SWI/SNF复合体组装的结构背景下解释了这些结果。正如在之前的体内筛选中观察到的那样，三个最重要的命中是在cBAF复合物中（Arid1a、Smarcc1和Smarcd2），而且明显是在复合物的位置，可以被复合物的其他形式中的准分子所取代。这些结果表明，对cBAF复合体亚单位基因的扰动可以提高T细胞的持久性和体内抗肿瘤免疫力。

扰乱ARID1A可提高原代人类T细胞的持久性

接着，他们进一步研究cBAF亚基的扰动是否也能提高原代人类T细胞在体外慢性刺激实验中的持久性。因此，他们将针对ARID1A的CRISPR- Cas9 sgRNA核糖核酸蛋白（RNPs）（两个独立的sgRNAs）或对照RNP引入原代人类T细胞。然而，在慢性刺激的培养物中，ARID1A-sgRNA细胞的增殖明显多于CTRL T细胞，并保持较高的生存能力。他们接下来验证了ARID1A- sgRNA T细胞在体内的持久性优势。他们为体内的人类T细胞实验设计了一个CRISPR迷你库，其中包括48个sgRNAs，涉及20个基因，并包括8个阴性对照指南。与两个供体的输入样本相比，靶向ARID1A的sgRNAs在肿瘤中明显富集，表明cBAF限制T细胞持久性的功能在人类T细胞中是保守的。

体内Perturb-seq揭示了TILs中染色质重塑复合物的不同转录效应

为了了解驱动CRISPR筛选出的命中率提高的T细胞功能的分子机制，他们进行了Perturb-seq，它同时捕获CRISPR sgRNAs和单细胞中的转录组。他们针对INO80和BAF复合物，设计了第三个定制的sgRNA池（micro-pool）。经过质量控制过滤，他们从70,646个细胞中获得了高质量的scRNA-seq谱，并确定了6个集群。他们确定了52,607个细胞的高置信度sgRNA身份。细胞类型集群表达了不同水平的抑制性受体、效应性细胞因子和关键转录因子，表明它们代表了前驱和效应性T细胞的混合。他们使用每个LCMV T细胞集群的前100个标记基因，根据这些特征基因组的平均表达量，对他们Perturb-seq数据集中的每个单细胞进行评分。可视化这些LCMV特征在每个簇中的富集程度，显示了几个簇与参考数据集中的细胞类型的转录相似性。

随后，他们进行了sgRNA水平的质量控制，以评估独立sgRNAs效果的可重复性。他们首先计算了每个sgRNA和数据集中所有其他细胞之间的基因表达差异。相对于针对不同基因的sgRNAs对，针对同一基因的独立sgRNAs具有高度相关的基因表达变化。最后，他们检查了含有每种sgRNA的细胞的细胞型簇组成。所有扰动都含有来自每个体积的具有相似比例的细胞，这表明每个靶基因的耗尽可能不会影响细胞类型组成的整体变化，而是调节一个或多个簇中的基因表达。

为了进一步研究这种可能性，他们将含有针对同一基因的sgRNA的细胞聚集起来，并计算出与CTRL1细胞相比，每个扰动的不同基因表达。这些数据表明，cBAF和INO80染色质重塑复合体的亚单位在T细胞耗竭中具有不同的作用，这些作用在同一复合体中基本保持不变，cBAF主要调节效应器和耗竭相关基因，INO80调节代谢。此外，靶向染色质重塑因子的转录影响与先前已知的靶点Pdcd1和Gata3的影响重叠最小，这表明有可能协同靶向多种途径来改善T细胞功能。

Arid1a的扰动限制了终端耗竭相关的染色质可及性的获得

他们接下来研究了Arid1a扰动如何影响T细胞耗竭的外显结构。CTRL1细胞的染色质状态进展与之前在未受干扰的细胞中观察到的相似；然而，Arid1a-sgRNA细胞沿着一个独特的轨迹前进，在两个时间点上都比CTRL1细胞更接近于初始和激活的样本。

在这项研究中，他们在慢性刺激的T细胞中进行了全基因组CRISPR筛选，这提供了一个调节T细胞耗竭的全面基因图谱。他们采用了完整的体外和体内筛选策略：（1）开发了与全基因组CRISPR筛选兼容的体外耗竭测定，使他们能够比以前的筛选扩大细胞数量和sgRNA库覆盖率，提供了一个无偏见的发现工具；（2）体内后续筛选确定了扰动，大大改善了免疫治疗相关肿瘤模型中的T细胞持久性。重要的是，这种策略恢复了已知的耗竭调节因子（包括Gata3），它已被证明在肿瘤模型中限制了T细胞的功能。然而，这些筛选也发现了新的基因，其中涉及染色质和核糖体重塑的表观遗传因子的富集程度令人惊讶，包括cBAF和INO80丛集。体内Perturb-seq实验显示，cBAF和INO80复合体亚基的耗竭影响了不同的基因进程：cBAF扰动导致效应程序的上调和终端耗竭基因的下调，而INO80扰动主要影响与代谢功能有关的基因表达。最后，对cBAF复合体子单元Arid1a的耗竭改善了T细胞在体外和体内竞争试验中的持久性，并提高了采用T细胞转移后的抗肿瘤免疫力。

教授介绍：

Ansuman Satpathy，斯坦福大学医学院病理学系的助理教授，斯坦福癌症研究所、帕克癌症免疫治疗研究所、免疫学、癌症生物学和生物医学信息学项目Bio-X的成员、ChEM-H的教员。Satpathy课题组专注于开发和应用基因组规模技术来研究免疫系统在健康、感染和癌症方面的基本特性。他们在免疫学、癌症生物学和基因组学方面，研究对癌症的免疫反应的细胞和分子机制，特别是利用高通量基因组技术来了解肿瘤特异性T细胞对癌症抗原和免疫疗法（检查点阻断、CAR-T细胞和其他）的反应动态。他们还对了解免疫编辑对癌症的异质性和克隆进化的影响感兴趣。

参考文献：

Belk JA, Yao W, Ly N, et al. Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence [published online ahead of print, 2022 Jun 17]. Cancer Cell. 2022;S1535-6108(22)00231-8. doi:10.1016/j.ccell.2022.06.001