Co-IP-ChIP-EMSA-Pull down

一、技术简介
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档，已成为研究蛋白质相互作用的经典方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的很多蛋白质-蛋白质见的相互作用被保留下来。如果以细胞中某蛋白质为抗原，加入相应抗体，那么该抗体就能与抗原，以及与该抗原具有相互作用的蛋白质之间形成免疫复合物，一起沉淀下来。经过SDS-PAGE电泳，western blot和（或）质谱可鉴定出与抗原相互作用的蛋白质。

实验流程

实验流程

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS。
2. 按比例加入适量预冷的RIPA 缓冲液。
3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4°C，缓慢晃动（EP管插冰上，置水平摇床上）。
4. 4°C离心后，立即将上清转移到一个新的离心管中。
5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂
   糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。
6. 按比例加入Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。
7. 4°C离心后，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子。
8. 用BCA法测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）。
9. 用PBS将总蛋白稀释到合适浓度。
10. 加入一定体积的预先稀释的一抗。
11. 4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育。
12. 加入Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h。
13. 瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的洗液（或PBS）洗3遍。

14. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻
    -20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

    
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Co-IP和GST pull-down原理区别

• GST pull-down方法的基本原理是：利用重组技术将探针蛋白与GST融合，融合蛋白通过GST与固相化的载体上的GTH
• 亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

Co-IP和GST pull-down实验操作区别

• Co-IP实验为体内实验条件，蛋白质的相互作用可以在天然状态下进行，其优点为可以避免人为影响，还可以分离得到
• 天然状态下相互作用的蛋白复合体，缺点是无法证明两个蛋白之间是直接的相互作用还是间接的相互作用；GST pull-down实验为外实验条件，可以去除其它蛋白的影响，从而确定目的蛋白和待检测蛋白是否可以发生直接相互作用。
  但由于其实验条件为非天然条件，可能会使实验结果出现假阳性，即因为电荷作用的影响造成的吸附，而不是生理性的
  相互作用。

CHIP(染色质免疫共沉淀实验)

主要研究DNA与组蛋白或DNA调节蛋白等的相互作用，先用免疫纯化除结合的DNA和蛋白，然后再将纯化的DNA进行检测

凝胶阻滞迁移电泳检测服务（EMSA）

• 凝胶迁移或电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一种研究DNA/RNA结合蛋白和其相关的DNA/RNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。
• 依据实验需要，设计标记探针、非标记探针、蛋白特异性抗体等参照物，基于DNA-蛋白质或RNA-蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理，当转录因子与特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。

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EMSA原理示意图

赛默飞：https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/gel-shift-assays-emsa.html

EMSA收样注意事项（芭菲尔）

1. 标本收集与保存：
   (1) 组织样品—新鲜组织放入液氮或-80℃度保存，组织不少于100mg（约绿豆大小）；
   (2) 培养细胞—通过细胞计数取不少于1*106个细胞于EP管，加入0.5 mL生理盐水或蛋白保护剂，混匀后保存于冰箱 （-80℃，避免反复冻融）；
   (3) 血液细胞标本—以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5 mL生理盐水或蛋白保护剂，保存（-80℃可长期保存，避免反复冻融）；
   (4) 血清或细胞培养液标本—离心去掉杂质后取上清入EP管，保存（4℃可保存15-20天，-80℃可长期保存，避免反复冻融）；
   (5) 蛋白样本—依据实验设计每张膜至少提供50μL，浓度大于0.5 mg/mL。

简要区分EMSA、染色质免疫共沉淀、免疫共沉淀、免疫沉淀、pull-down实验

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