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悬浮细胞的siRNA转染操作步骤

悬浮细胞的siRNA转染操作步骤

作者: 实验小助手 | 来源:发表于2023-11-21 10:19 被阅读0次

    悬浮细胞的siRNA转染操作步骤,以24孔板siRNA转染为例

    1.提前1天细胞种植

    悬浮细胞:采用对数生长期的细胞,数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105,那么就用2×105的细胞进行转染。

    2.转染过程

    ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA,加入一定量无血清稀释液,充分混匀,制成RNA稀释液,终体积为25μl。

    注意:无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

    ⑵取1ul的EntransterTM-R4000,然后加入24ul无血清稀释液体,充分混匀,制成EntransterTM-R4000稀释液,终体积为25μl。室温静置5分钟。

    ⑶将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上)混合,室温静置15分钟。转染复合物制备完成。

    ⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基(可含10%血清和抗生素)的细胞上,前后移动培养皿,混合均匀。

    注意:对本试剂,采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

    ⑸转染后6小时观察细胞状态,如状态良好可不必更换培养基,继续培养24-96小时得到结果。

    注意:1.siRNA转染后,继续培养24-72小时在mRNA水平得到结果,继续培养24-96小时在蛋白水平得到结果。mRNA转染后,根据需要在24小时后得到结果。

    2.在部分实验室,由于血清和培养条件等差异,转染后镜下培养基中可能出现少量黑点状沉淀,为转染试剂和血清中蛋白结合产物,不影响转染结果和细胞状态,可通过换液除去。

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