miRNA+囊泡套路

知识

miRNA 的转录和转录后的加工成熟，位于供体细胞 miRNA 由一个茎环结构的前体加工而来

miRNA 与结合靶基因 mRNA（发挥生物学功能），发生在受体细胞

miRNA 的经典作用机制是结合下游的靶基因的 mRNA 并抑制 mRNA 的翻译表达

细胞交互+miRNA

数据上有扩充：

1. 供体细胞里面 miRNA 的表达、分泌的情况

2. 包裹在囊泡中的 miRNA 是否被受体细胞接收

3. 受体细胞中 miRNA 结合靶基因的表型这个工作量相当于是两套 miRNA 靶基因数据集合到一篇文章

☆实操步骤

上一策叫半壁江山半套
这一策可以看成两个半套合成完整一套，可以分成上下两部分数据

上半部（揭示现象、阐释机制）
供体细胞中主变量 miRNA 的表达变化
细胞培养上清中分泌的囊泡数量以及内含的 miRNA 数量

下半部
受体细胞接受囊泡中的 miRNA
明确 miRNA 来自外源导入，并非是受体细胞内合成的增加
在此基础上解释清楚主变量 miRNA 的功能以及它下游的靶基因机制
建立 miRNA 跟疾病相关表型的联系

具体10步

第一步确认细胞相互交互：用供体细胞的培养上清处理受体细胞，观察受体细胞表型变化相当于加药，用法和标评价表型是否变化这步相当于预实验
细胞交互的课题的前提就是存在交互，以此为基础进行后续研究
交互分为：

直接接触（不推荐）
2.通过分泌分子或囊泡运输（更有延展性）√

第二步：表达差异

细胞上清样品抽提外泌体送 miRNA 芯片测序，找差异的 candidates list （ 27 策）

在细胞交互课题中，表达差异放在第二步。原因： 1、该课题前体是有交互，否则立论不成立 2、供体细胞上清加到受体细胞，非常简单，不涉及基因操作

第三步，锁定外泌体中差异表达的 miRNA 分子，操作分子(正反回复)看表型，验证功能

1）怎么操作？

√在供体细胞过表达或者沉默 miRNA，然后同样再用细胞上清去孵育受体细胞，与对照组没有操作分子的培养上清进行比较，看表型是不是被阻断

X 错误的做法：在外泌体上操作主变量，把 miRNA 转染进外泌体这是没法弄的

2）一正或一反，只做阻断 loss of function 就可以
问：为什么这一步不正反回复做全？
我们通常倾向于研究高表达的分子，所以这步一般沉默 miRNA 且细胞交互课题数据量庞大，第三步才刚开始，后面还有重要数据
两种方法：
1 沉默 miRNA
2 用商业化抑制剂阻断外泌体合成必要的酶，或封闭或沉默参与外泌体释放的关键蛋白(相当于拆运输载体)

第四步，从供体细胞的上清提取、分离并鉴定外泌体（鉴定囊泡）
分离试剂盒：有专门的商业化试剂盒

分离原理：离心、色谱、过滤、基于高分子聚合物的沉淀、免疫亲和分离
鉴定：
透射电镜，观察外泌体形态
 动态光散射 DLS，分析颗粒粒径大小，颗粒密度
 ZETA 电位，检测颗粒电荷
 Western、免疫荧光检测外泌体 marker（组织细胞蛋白）
常见的有热休克蛋白 HSP70，TSG101，cd63，需查文献整理
 ELISA 检测体液中的分泌蛋白
注意：western 和 ELISA 都是检测蛋白，但检测的对象不同，前者为体液中的分泌蛋白，后者为组织细胞蛋白 qPCR、芯片、测序监测非编码 RNA

△第五步，用亲脂性的荧光染料（DII、DID、DIO、DIR）标记示踪外泌体，观察受体细胞的对外泌体的摄入情况
荧光染料是一些差不多的衍生化合物荧光染料进入细胞膜前，荧光很多，结合细胞膜后，荧光强度大大增加荧光进入细胞后，使细胞显色这步属于鉴定囊泡的特殊步骤，属于细胞交互的特殊配置如果是 circulating 分子，不经由囊泡，可以直接标记分子观察摄入的情况

第六步，观察受体细胞中的主变量表达变化和表型变化
（逻辑：主变量→表型，单变量表型论证），但是操作环节在供体细胞

第七步：动物表型验证（非必须）

预防性策略：先分子操作，再打动物
治疗性策略：先制作模型，再直接打分子操作工具

细胞交互课题中，两种策略：动物水平直接操作分子，改变分子表达产生表型在供体细胞上操作分子，用供体细胞的培养上清或上清的提取物注射动物条件更苛刻：不仅需要分子操作，还必须是分泌的才有作用具真正意义注意：这一步非必须，通常第六步后是探讨分子机制，建立多元变量调控关系

第八步，先下后上，探索受体细胞 miRNA 靶基因的直接作用机制，或分子加通路的间接机制
MiRNA 靶基因直接机制，同 11 策 Mimics miRNA→靶基因↓ Inhibitor miRNA →靶基因↑ 操作 miRNA+操作靶基因（反正正，反反反）→ 表型回复！
不同点：操作主变量或阻断外泌体永远在供体细胞，rescue 操作靶基因或下游通路在受体细胞

第九步，上游机制，也有直接和间接

解释主变量释放增加的原因：本身表达增加？还是细胞分泌增加？
1 MiRNA 可以在基因、转录、转录后三个水平来探讨
2 其他的分子类型可以从基因、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平挖掘机制
3 另外，circulating 的分子可以从是直接分泌还是囊泡运输来分泌进行探索就像分子修饰找上游的酶因为分子的范围不大，是有限分子的结合以上的路不一定都能走通，走通一条就可以 ！注意：研究外泌体介导的信号传导过程中，有特异性和非特异性两种作用方式
非特异性是指受体细胞，它什么外泌体都吞，不挑食，来了就吃特异性作用指外泌体表面有膜蛋白
 外泌体表面是一个双层脂质结构，跟细胞膜一样，有膜蛋白（内容物也有蛋白）
 这个膜蛋白也可以结合受体细胞膜表面的受体，通过配体受体的结合来增加识别的特异性，这就把问题进一步复杂化了
 如果一篇文章它既没有做供体细胞主变量为什么表达上升，也没有做外泌体的合成和分泌变化，却探讨了外泌体识别受体的膜蛋白，也是上游机制

第十步，跨空间 rescue
细胞交互是一个多步骤的过程当分子经由囊泡分泌，阻断囊泡合成、分泌以及靶细胞对囊泡的识别和摄入都可以设计 rescue。
这个设计目的主要说明该信号传递依赖于囊泡，是必要性论证
外泌体+miRNA 套路之所以看起来复杂，因为有多处操作可以分裂比如操作主变量这步，如果操作外泌体，效果相同还兼容直接机制的数据，
如 MiRNA+靶基因就是最简单的直接机制其他更复杂的蛋白蛋白交互、蛋白 RNA 交互加外泌体的注意事项在下次课降解
！注意：多变量 rescue 设计容易出错要点：围绕主变量进行设计细胞交互课题新增一条逻辑证明：变量间的调控关系依赖于细胞交互因变量与因变量之间的 rescue 设计往往可以省略