Author: Junfei Xie
Date: 09-10-2021
组织解剖及预处理：
实蝇冰上麻醉，放入75%酒精中消毒3分钟，然后转入PBS清洗；
清洗干净的果蝇放入盛放Grace's Insect Medium培养皿中，小心解剖出需要的组织；
组织转移入4%多聚甲醛PFA中，室温固定1h;
用800ul PBTT在室温通透化处理15min；
PBTT洗涤三次，每次5min；
PBS洗涤样品两次，每次5min;
用PBT：RNA杂交液=1：1，洗涤一次，然后样品储存在RNA杂交液中。
预杂交
RNA杂交液煮沸5分钟，冰上骤冷5分钟；
样品加入杂交液中，56℃孵育2h;
杂交
探针用RNA杂交液稀释，比例1：50——1：2000；
加热探针80℃，5min，冰上骤冷5min；（对于短探针<50nt，无复杂二级结构则无需此步骤）
样本加入探针杂交液中，56℃杂交12h（短探针30nt-80nt，孵育时间30min-2h）
样品转移至DAPI染色液中孵育30min；
洗涤
预热杂交液至56℃，洗涤样品3次，每次15min;
用PBT洗涤5min;
转移入PBS中洗涤5分钟；
制片
避光保存的样品转移至体式荧光显微镜下，
在载玻片中央滴加一滴抗淬灭剂，样品放入淬灭剂，并解剖脂肪体至细小碎块，分散开来。
用盖玻片从一端慢慢下压，完全覆盖在样品上，切勿左右移动盖玻片。
吸取多余淬灭剂，并用指甲油封闭玻片四周，晾干避光保存。
试剂
| 中文名 | 英文名 | 体积（ml) |
|---|---|---|
| 甲酰胺 | Formamide | 25 |
| 20*盐-柠檬酸钠缓冲液 | 20*SSC | 12.5 |
| 肝素 | Heparin (5 mg/ml) | 0.5 |
| 酵母tRNA*** | Yeast tRNA (50 mg/ml) | 0.5 |
| 柠檬酸(0.5 M pH=6.0) | Citric acid (0.5 M pH=6.0) | 0.92 |
| 焦碳酸二乙酯处理水 | DEPC*H2O | 10.33 |
| 20%吐温20 | 20% Tween 20 | 0.25 |
***：临用前加入
说明：
- 4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。通常组织块固定4～12h，载片固定时间在10～15min以内，RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。
- 甘氨酸有终止蛋白酶K作用的作用，以防过度消化（本操作无）。
参考资料：
[1]刘冀珑. 果蝇组织荧光原位杂交[J]. Bio-101, 2019:1010301.
[2] Lecuyer E , Necakov A S , Caceres L , et al. High-resolution fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos and tissues.[J]. Csh Protoc, 2008, 2008(6):0-0.
[3] Nizami Z F , Liu J L , Gall J G . Fluorescent In Situ Hybridization of Nuclear Bodies in Drosophila melanogaster Ovaries[J]. Methods in Molecular Biology, 2015, 1328:137-149.
[4] Wilk R , Hu J , Krause H M . In Situ Hybridization: Fruit Fly Embryos and Tissues[J]. John Wiley & Sons, Inc. 2017.
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