用topGO进行GO富集分析

topGO是一个半自动的GO富集包，该包的主要优势是集中了好几种统计检验的方法，目前支持的统计方法如下：

一、安装

BiocManager::install('topGO')
需要R的版本为>=2.10，但biocmanager安装需要的R版本更高，现在应该是3.6。

二、数据准备

富集工作主要包括3个步骤：
1、准备相关数据；
2、进行富集统计检验；
3、分析结果。
所以最重要的工作就是数据的准备。需要的数据包括包含全部geneID（背景基因名，一般是研究物种的全部基因）的文件，需要进行富集分析的geneID（差异表达基因或感兴趣的基因）文件，还有gene-to-GO的注释文件。

物种全部的geneID和差异基因ID比较容易获得，比较费劲的是gene-to-GO文件。
topGO提供了一些函数来帮助我们自动获取注释信息：
annFUN.db：用于Bioconductor上有注释包的物种的芯片数据；
annFUN.org：用于Bioconductor上有“org.XX.XX”注释包的数据；
annFUN.gene2GO：用户自己提供gene-to-GO文件；
annFUN.GO2gene：用户提供的GO-to-gene文件也可以；
annFUN.file：读取有gene2GO或GO2gene的txt文件。
一般Bioconductor提供的注释物种并不多，我的方法主要是用AnnotationHub的select函数或biomaRt的getBM函数来获取，具体操作见:https://github.com/xianyu426/gene_annotation

自己提供gene2GO文件时，格式应该为：
gene_ID<TAB>GO_ID1, GO_ID2, GO_ID3, ....

三、数据导入

library(topGO)
# 读取gene-to-GO mapping文件
gene2go <- readMapping(file = "gene-to-GO文件") # 这里我用的是物种全部的基因对应GO文件
# 读取差异基因文件
DEGs <- read.table("差异基因文件", header = TRUE)

# 定义背景基因和感兴趣基因
genenames <- names(gene2go)
genelist <- factor(as.integer(genenames %in% DEGs$geneid)) 
# 这里会生成一个factor，有两个levels：0和1，其中1表示感兴趣的基因。
names(genelist) <- genenames
GOdata <- new("topGOdata", ontology="MF", allGenes = genelist, 
              annot = annFUN.gene2GO, gene2GO = gene2go)

这样就定义了一个topGOdata对象。

四、统计检验

test.stat <- new("classicCount", testStatistic = GOFisherTest, name = "Fisher test")
resultFisher <- getSigGroups(GOdat, test.stat)
test.stat <- new("elimScore", testStatistic = GOKSTest, name = "Fisher test", cutOff = 0.01)
resultElim <- getSigGroups(GOdata, test.stat)
test.stat <- new("weightCount", testStatistic = GOFisherTest, name="Fisher test", sigRatio = "ratio")
resultWeight <- getSigGroups(GOdata, test.stat)
test.stat <- new("classicScore", testStatistic = GOKSTest, name = "KS tests")
resultKS <- getSigGroups(GOdata, test.stat)
elim.ks <- runTest(GOdata, algorithm = "elim", statistic = "ks")
allRes <- GenTable(GOdat, classic=elim.ks, KS=resultKS, weight = resultWeight,
                   orderBy = "weight", ranksOf = "classic", topNodes =10)
write.table(allRes, file = "sig_GO_result.txt",
            row.name = FALSE, col.names=TRUE)

结果可以作气泡富集图。

五、显示结果

showSigOfNodes(GOdata, score(resultWeight), firstSigNodes = 10, useInfo = "all")