EASI Transformation: An Efficient Transient Expression Method for Analyzing Gene Function in Catharanthus roseus Seedlings[J]. Frontiers in Plant ence, 2019, 10:755.

DOI：10.3389/fpls.2019.00755

EASI转化：一种分析长春花苗基因功能的有效瞬时表达方法

Mortensen S , Bernal-Franco D , Cole L F , et al. 

长春花属植物是具有抗癌价值的萜类吲哚生物碱、长春花碱(Vb)和长春新碱(Vc)的唯一来源。目前玫瑰花转录组和基因组资源的可获得性，迫切需要一种快速、可靠的方法来研究基因功能。在这项研究中，我们开发了一种农杆菌介导的瞬时表达方法，使植物中基因的功能快速研究，保留了在VB和VC途径中观察到的区间化现象。我们的重点是(1)改进转化方法(注射器与真空农业渗透)和培养条件(苗龄、农杆菌密度和转基因表达最高的时间点)；(2)通过毒性基因的组成性表达和抑制RNA沉默机制来提高转化效率；(3)通过引入内含子、定量和定性报告基因(荧光素酶和GUS基因)来改进载体设计，并使用内部对照来解释跨组织转化的异质性。在试验的所有参数中，真空渗入(10d龄，感染后3d收获)的转基因表达量最大，比其他苗龄的真空渗入和注射器渗入高18-57倍。赋予根癌农杆菌突变的VirGN54D或在与报告基因相同的质粒中沉默抑制子，进一步提高了2-10倍的表达量。为了准确测量启动子的反式激活或活性，我们包括了一个内部对照，以归一化植株质量和转化效率的差异。将归一化基因(Renilla荧光素酶)与报告基因(萤火虫荧光素酶)连接到同一质粒上，可持续产生高信号，且RLUC与FLUC之间高度相关。作为原理的证明，我们应用这种方法研究了著名的激活剂ORCA3和阻滞剂ZCT1对CroSTR1启动子的调控。我们的方法证明了定量评估玫瑰花中启动子活性的激活和抑制。我们高效的农杆菌介导长春花苗苗渗透瞬时表达法(EASI)可以高效、可重复、均质地转化长春花子叶，为社区快速评估植物基因的功能，特别是研究转录因子如何调控萜类吲哚生物碱的生物合成提供了一个及时的工具。

关键词：长春花，农杆菌渗透，瞬时转化，反式激活，ORCA3，ZCT1，突变病毒，病毒沉默抑制剂

Keywords:Catharanthus roseus, agroinfiltration, transient transformation, transactivation, ORCA3, ZCT1, mutated VirG, viral silencing suppressors

1介绍

植物产生大量的专门代谢物，使其能够适应环境挑战。例如，植物产生的化合物可以吸引传粉者或阻止病原体和食草动物(Weng等人，2012年)。对人类来说，这些专门的代谢物是有用化学物质的重要来源，特别是药物(Balunas和Kinghorn，2005；Wurtzel和Kutchan，2016)。

在过去的五年中，药用植物的转录和基因组资源的可用性有了很大的增长，例如药用植物基因组资源1、植物MetaSyn2和1000植物倡议3。此外，代谢组技术的进步现在使得单细胞和空间代谢物图谱成为可能(Wurtzel和Kutchan，2016)。这些方法正在加速识别重要的药物化合物的生物合成以及用于调节其生物合成基因的候选基因。对这一不断增长的基因清单进行功能研究是非常有必要的。为此，我们开展了药用植物长春花属植物的基因功能研究。G.Don(vander Heijden等人，2004年；Facchini和De Luca，2008年)。

长春花产两种有效的抗癌萜类吲哚生物碱(TIA)，长春花碱和长春新碱，这是在20世纪50年代调查该植物治疗糖尿病的声誉时偶然发现的(Noble，1990)。由于抗癌TIA仅在玫瑰花叶中微量发现(Andersson等人，1996年)，它们是生物技术手段生产的目标(vanderHeijden等人，2004年)。玫瑰花的第一个全面转录组资源于2012年发布(Góngora-Castillo等人，2012年)，第一个部分基因组于2015年发布(Kellner等人，2015年)。这些资源和其他资源的可获得性使得抗癌化合物长春花碱和长春新碱的两种前体--长春花碱和长春花碱的生物合成途径得以充分阐明(Qu等人，2015年，2018年；Caputi等人，2018年)。该途径涉及28种已知的酶，分布在叶片的几种细胞类型中，包括内部韧皮部相关的薄壁细胞、表皮、激光/异成体细胞和不同的亚细胞隔室(潘等人，2016年综述)。还鉴定了多个转录因子和转运蛋白基因，这些转录因子和转运蛋白基因参与了途径中间产物的跨隔室运输(Menke等人，1999；Pasquali等人，1999；vander Fits and Memelink，2000；Chatel等人，2003；Pauw等人，2004；Suttipanta等人，2011年；张等人，2011；Yu和DeLuca，2013；V anMoerkercke等人，2015,2016；Paul等人，2017；Payne等人，2017；Patra等人，2018)。以前通过表达单途径基因或改变转录因子的表达来增加生物碱产量的尝试取得的成功有限，这表明研究其生物合成的复杂调控的重要性(Rizvi等人，2016年；Schweizer等人，2018年；Sun等人，2018年；Pan等人，2016年综述)。需要工具来快速评估在适当的组织类型中对长春花碱和长春花碱生物合成的调节，以便在未来工程上增加产量。

与拟南芥、烟草和其他模式植物相比，评估玫瑰花基因功能的方法受到限制。就像在其他植物中一样，通过组织培养再生来开发转基因植物是耗时、昂贵和取决于基因型的(赵等人，2017年)。鲜有关于玫瑰花中转基因植物发展的报道(潘等人，2012；Wang等人，2012)。在玫瑰花中，转基因毛状根的发展是普遍追求的，因为存在一种有效和可靠的方法(Choi等人，2004年；Rizvi等人，2015年)。然而，使用毛状根的缺点是，TIA途径的许多基因在根和叶中的调控方式不同(潘等人，2016)，而且毛状根的发育需要4-6个月。因此，毛状根的产生不适合于叶片特异候选基因的快速筛选。

为了更快地评估基因功能，烟草等模式植物已被用于玫瑰花基因启动子反式激活的研究(V anMoerkercke等人，2015,2016；Paul等人，2017；Patra等人，2018；Schweizer等人，2018)。然而，长春花碱途径仅在玫瑰花中发现。因此，需要研究长春花碱途径的调控，包括监测表达和代谢物水平。利用生物转化、农杆菌或电穿孔等方法在愈伤组织、细胞悬浮液和原生质体中成功地进行了瞬时转化玫瑰花的初步尝试(vander Fits andMemelink，1997；Guirimand等人，2009；Suttipanta等人，2011年)。然而，这些系统缺乏在主要发生长春花碱生物合成的子叶和叶片中观察到的专门细胞或亚细胞区划(Aerts等人，1994年；Pan等人，2016年)。生物转化或原生质体转化的其他缺点包括转化率低，需要专门的设备，以及广泛的优化。随后玫瑰花的瞬时转化尝试主要集中在农杆菌介导的离体叶片瞬时转化(DiFiore等人，2004年)、花瓣瞬时转化(V an Moerkercke等人，2016年，改编自(Verweij等人，2008)和幼苗(Makhzoum等人，2011；Weaver等人，2014)。然而，我们观察到成熟组织的转化效率很低(未发表的数据)。此外，花瓣瞬时转化法要求从特殊光周期下生长的植物上收获的花在温室里全年开花。在这些组织中，幼苗是理想的，因为它们具有完整的植物组织结构，可以在几天内获得，并且可以在实验室的组织培养箱中培养。

在这项研究中，我们发展了一种在玫瑰花属植物幼苗中瞬时表达的方法，以便在植物中快速研究基因的功能，保存在长春花碱途径中观察到的区域化。我们完全修改了我们的农杆菌介导的瞬时表达方法(Weaver等人，2014年)，重点放在三个主要方面：(1)改善吞吐量(注射器与真空渗透)和培养条件(苗龄、农杆菌密度和转基因表达最高的时间点)；(2)通过毒性基因的组成性表达(通过成分活性的Virg)和抑制RNA沉默机制(通过病毒沉默抑制子)来提高转化效率；以及(3)通过整合内含子、定量和定性报告基因(荧光素酶和GUS基因)来改进载体设计，并使用内部对照来解释跨组织转化的异质性。

为了研究TIA生物合成的调控，我们建立了这一定量瞬时表达分析方法。考虑到萤火虫和雷尼拉荧光素酶报告基因的敏感性、动态范围和时间分辨率，我们选择了萤火虫和雷尼拉荧光素酶报告基因来准确测定转录因子和启动子的活性。作为原理的证明，我们应用我们的瞬时表达实验证明了马钱子苷合成酶(STR1)启动子被十八烷类反应性长春花属AP2(ORCA3)转录激活剂(van der Fits and Memelink，2001)和长春花锌指蛋白家族的抑制子(ZCT1)的反式激活(Pauw等人，2004年)。总之，我们开发了一种可重复性、健壮和高效的瞬时表达方法，称为高效农杆菌介导的幼苗渗透(EASI)方案，用于研究玫瑰幼苗的基因功能。这种低成本的方法不需要专门的设备，具有高转换率、高吞吐量和快速生成结果的特点。

2材料和方法

2.1玫瑰花苗木的制备

将0.8g种子(小亮眼，NESeed)浸泡在20ml的5%植物防腐剂混合物(Caisson实验室)中，在25◦C的黑暗中(第0天)进行16h的表面灭菌。去掉5%的PPM后，将种子均匀地铺在全强度的Gamborg培养基(3.1g/L的Gamborg‘s基盐，1ml/L的Gamborg’s维生素(1000倍)，6%的1型微繁殖琼脂，植物技术实验室)上，放在无菌的MagentaTM盒(Sigma)中(第1天)。种子在25◦C的黑暗中保存7d，大部分种子萌发，处于钩期(即幼苗子叶向下，下胚轴长约1cm)。在第8天，将品红盒子中的幼苗转移到室温下16h的光照(Erligpowht 45W LED红蓝光)和8h的黑暗中2d(除“V型渗透幼苗最佳转基因表达”部分随着苗龄的优化而变化外)。在第10天，将幼苗转移到完全黑暗的环境中16h，然后再进行农杆菌渗透，以提高瞬时转化的能力(Lee和YAng，2006)。我们计算了幼苗的年龄，从它们在甘堡的培养基上传播到开始发芽的那一天开始。

2.2月见草苗的农业渗入

瞬时表达分析利用了非致瘤农杆菌GV3101(PMP90)菌株(Koncz等人，1992)。将表达质粒电穿孔转化农杆菌，接种于含有庆大霉素(10µg/ml)和适当抗生素的LB琼脂培养基上，筛选表达载体。经菌落聚合酶链反应验证，在26◦C、250rpm的含抗生素LB培养基中培养过夜。从新鲜生长的液体培养物中制备甘油库存，并将其储存在−80◦C中长期储存。

在农业渗透前4天，用庆大霉素(10µg/ml)和适当的抗生素将甘油库存中的农杆菌新鲜接种到LB琼脂平板上，在26◦C下培养2-3天。用平板上的新鲜单个菌落接种10ml含有适当抗生素的LB液体培养基，在26◦C以250rpm的速度培养过夜。将农杆菌离心(7000×g，6min)，再悬浮于含有适量抗生素和100µM乙酰丁香酮(AS)的10ml农杆菌微量培养基中，在2 6◦C和250rpm条件下培养3h。最小农杆菌培养基组成为葡萄糖5g/L，NH4Cl 1g/L，MgSO4 0.3g/L，KCl 0.150 g/L，CaCl2 0.010g/L，FeSO4 0.0025 g/L，K2HPO4 3 g/L，NaH2PO4 1 g/L，MES 0.195 g/L，pH=5.5时缓冲。

为准备农业渗透，将农杆菌细胞离心(7000×g，6min)，并在新鲜添加200µM AS的渗透培养基(Lee and Y Ang，2006；10 mM MgSO4，10 mM MES，pH 5.6)中，在600nm处重新悬浮至所需的OD值。用不必要的注射器或在真空下对10天、14天和21天的幼苗进行农业渗透。真空浸渍时，在浸渍介质中加入0.01%的Silwet L-77。

2.2.1注射浸润

用5ml无针注射器将农杆菌渗透到单个子叶的远轴侧。这种方法不能用于10日龄的幼苗，因为子叶比注射器小。在注射器渗透后，幼苗保存在装有Gamborg培养基的洋红色盒子中，在黑暗中保存48h，然后转移回16h/8h的光周期中24h。

2.2.2真空渗透

将幼苗(25-30株)从洋红盒子轻轻转移到装有50毫升渗透介质的100毫升玻璃瓶中。将不带盖的瓶子放入真空干燥器内，真空2次，时间4min，不真空间隔4min。在真空渗透后，幼苗被转移到装有新鲜甘堡培养基的洋红色盒子里，轻轻地将根种植到培养基中，帮助幼苗站立起来。幼苗在黑暗中保持48h，然后转移到16h/8h的光周期中24h(通常)或所需的时间。

2.3玫瑰花的发育阶段

我们在三个早期发育阶段对农杆菌介导的玫瑰花苗转化进行了评估，以最大限度地减少进行瞬时表达程序所需的时间。发育阶段为：(1)10日龄幼苗(黑暗中7d，16h/8h光周期3d)，子叶小而开放，呈绿色；(2)14日龄幼苗(黑暗中7d，16h/8h光周期7d)，子叶较大，但看不见真叶；(3)21日龄幼苗(黑暗中7d，16h/8h光周期14d)，第一批真叶长约4mm。

2.4瞬态变换评估

我们利用GUS基因和荧光素酶基因对农杆菌介导的玫瑰花苗转化进行了定性和定量评价。为了进行定性评价，在花椰菜花叶病毒2X35S启动子(β2X35S，附图S1和图6)的控制下，将编码内含子的葡萄糖醛酸酶基因(GUS)的质粒瞬时转化幼苗，并进行GUS染色。

为了进行定量评价，我们测量了不同启动子控制下含内含子萤火虫荧光素酶基因(Fluc-I)和农杆菌启动子(AtuMAS，图1)控制下含内含子肾素酶基因(RLUC-I)转化的幼苗的生物发光。将FLUC信号归一化为RLUC信号或通过Bradford蛋白分析(Bio-Rad)定量的蛋白质含量。对于每个实验，一个条件作为参考，其平均归一化熔剂活性设置为100%。为了计算相对活性百分比，将每个样品的归一化熔剂活性除以参照物的平均归一化熔剂活性。计算相对活性百分比便于对来自三个独立化验的汇集数据进行统计分析。对于每个检测条件，进行了10个生物重复(如果没有指定)；每个生物重复由两个10天大的幼苗或一个17天和24天大的幼苗组成。使用JMP，版本13(SAS Institute Inc.，Cary，NC，United States，1989-2007)对实验数据进行统计分析。

2.4.1GUS染色与成像

用5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸(X-Gluc)在25◦C的GUS染色液(50mM Na_3PO_4缓冲液，pH7.2，1.0 mM乙二胺四乙酸，0.1 mM K3Fe(CN)6，0.1 mM K4Fe(CN)6，20%(v/v)甲醇，700µg/ml X-Gluc)中孵育24h，然后用70%乙醇洗涤，直到叶绿素完全去除。图像用尼康SMZ800显微镜(尼康，日本东京)和Spot Insight CCD 2.0MP彩色相机(Diagnostic Instruments，Inc.，Sterling Heights，MI，United States)采集。

2.4.2蛋白质提取

将转化苗收获，在液氮中闪速冷冻，并在−80◦C下保存，直到蛋白质提取。冷冻组织用3 mm的珠子在珠子搅拌器中以4m/s的速度粉碎20s(MP Biomedals)，转移到冰中，加入130µl的提取缓冲液(50mMNa3PO4，pH7.2，1.0mMEDTA)，10 mMβ-巯基乙醇和0.1%Triton-X100新鲜加入。旋流离心(21000×g，2min)后，将约110µl的上清液转移到96孔板上，并在冰上保持。 

2.4.3萤火虫和雷尼拉荧光素酶测定

用Luc-PairTM萤火虫荧光素酶HT法分析FLUC活性，用Genecopeia公司的Luc-PairTMDuo-荧光素酶HT分析试剂盒分析FLUC和RLUC的活性。将植物蛋白提取物(20µl)与相应试剂盒中的20µl反应溶液在室温下混合。在96孔白板(CorningTM3992)的每隔一孔中分配样品，以避免孔间串扰。用平板阅读器读数2s，获得相对光单位(RLU)。

2.4.4蛋白质定量

采用Bradford比色法(BioRad)测定蛋白质含量。绘制了牛血清白蛋白在62.5~3000 ng/µl范围内的蛋白质标准曲线，并用二次多项式方程进行拟合。样品稀释1：2，以确保测定值在校准曲线的范围内。

图1|长春花苗龄和感染方式显著影响瞬时转化效率。用含有Fluc-I报告基因(质粒pSB97)的根癌农杆菌GV3101(PMP90)在OD600=0.2的条件下，用注射器或真空渗入10、14和21日龄的玫瑰花幼苗。取样时间为3dpi。将FLAC活性归一化为蛋白质含量。以10日龄真空渗水幼苗的平均FLOC活性与蛋白质含量的比值为参照(设定为100%)，确定每个样品的相对FLOC活性。实验在三个独立的分析中进行(用+、？、1符号表示)。方框图水平线显示中位数，方框末端显示四分位数范围，小标记显示第10和第90个分位数，胡须显示最低/最高数据点。不同的字母表示显著不同的值(对数转换后的数据进行Tukey-Kramer HSD检验，p<0.05)。

2.5向量构造

在载体构建过程中，所有的PCR反应都需要使用Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(New England BioLabs)，以避免在PCR过程中引入错误，本研究中使用的所有引物都列在补充表S1中。

2.5.1基于金门的模块克隆(MoClo)载体构建

使用基于金门的模块克隆构建所有最终载体(MoClo，Weber等人，2011年)。MoClo使用标准化的遗传元件(L0载体中的部分)将它们组装成转录单位(L1载体)。然后可以将来自L1载体的多个转录单元组装到最终的L2载体中。如果没有特别说明，主干载体和0级部分取自Golden Gate MoClo Plant Parts Kit和Golden Gate MoClo PlantToolkit(Weber等人，2011；Enger等人，2014)。按照Weber等人的描述组装更高水平的载体。(2011)，以获得本研究所需的最终向量。

新的L0部件的构造在补充材料(方法)中描述。所有新的启动子和编码序列都被克隆到L0受体载体中，如Weber等人所述。(2011年)。所有新构建的L0MoClo载体和最终的L2载体都存放在Addgene(Addgene ID 123180-123200)。

Hcpro序列(GB0067)是Diego Orzaez博士赠送的礼物(Addgene质粒#68196，Sarrion-Perdigones等人，2013年)。该矢量与MoClo兼容。

2.5.2含L2受体载体的VirGN54D的构建

使用NEBuilder(New England BioLabs)通过插入VirGN54D基因对pAGM4723(Weber等人，2011年)进行了修饰。用引物1和2从pAD1289(Hansen等人，1994)扩增出1153bp的含有VirGN54D基因的片段，用引物3和4扩增得到线性化的pAGM4723载体，将VirGN54D片段与线性化载体进行组装。所构建的载体骨架含有VirGN54D，命名为pSB90pAGM4723VirGN54D，登录于Addgene(AddgeneID 123187)。

图2|在真空渗透过程中，转基因表达与细菌密度直接相关。用含有Fluc-I报告基因(质粒pSB97)的根癌农杆菌在OD600=0.02、0.2和0.4的条件下真空渗透玫瑰花苗(10日龄)。取样时间为3dpi。将FLAC活性归一化为蛋白质含量。以OD600=0.2感染的幼苗的平均FLOC活性与蛋白质含量的比值为参考值(设定为100%)来确定每个样品的相对FLOC活性。实验在三个独立的分析中进行(用+、？、1符号表示)。方框图水平线显示中位数，方框末端显示四分位数范围，小标记显示第10和第90个分位数，胡须显示最低/最高数据点。不同的字母表示显著不同的值(对数转换后的数据进行Tukey-Kramer HSD检验，p<0.05)。

3结果

3.1用真空渗入的方法实现转基因的最佳表达

在初步实验中，我们评估了玫瑰花叶片对农杆菌介导的转化的适应性，观察到幼苗的转化率很高，但随着叶龄的增加转化率降低(数据未显示)。由于幼苗表现出最高的报告基因表达，并且可以在短时间内生产出来，所以我们对10、14和21日龄的幼苗进行了注射器渗透和真空渗透试验。10日龄幼苗的子叶太小，不能进行注射器渗透，因此在这个苗龄只能评价真空渗透的效果。

最高的转化效率出现在使用真空渗透的10日龄的幼苗中，导致FLOC活性比任何其他条件高18-57倍(图1)。这两种转化方法在14日龄和21日龄芽时的转化效率和转化效率都明显较低。14d和21日龄幼苗真空渗透和注射器渗透转化效率差异不显著。总体而言，与注射器渗透不同，10d苗的真空渗透始终具有较高的转化效率和最小的组织损伤。此外，真空渗透需要少组织处理，因此，真空渗透对10日龄的幼苗进行了瞬时转化过程中其他影响因素的优化。

图3|在感染后3天(Dpi)的幼苗中检测到最强的转基因表达。在OD600=0.2的条件下，用含有Fluc-I报告基因(质粒pSB97)的根癌农杆菌真空渗入10天龄的玫瑰花幼苗。取样时间分别为1、2、3、6和9dpi。将FLAC活性归一化为蛋白质含量。以在3dpi处采集的样品的平均FLOC活性与蛋白质含量的比值作为参考(设定为100%)来确定每个样品的相对FLOC活性。实验在三个独立的分析中进行(用+、？、1符号表示)。方框图水平线显示中位数，方框末端显示四分位数范围，小标记显示第10和第90个分位数，胡须显示最低/最高数据点。不同的字母表示显著不同的值(对数转换后的数据进行Tukey-Kramer HSD检验，p<0.05)。

3.2当农杆菌密度OD600=0.2和0.4时，转基因表达较高

农杆菌介导的瞬时转化方案在不同的植物物种中使用0.01至2个感染介质中的细菌密度(OD600)(Wroblewski等人，2005年；Cazzonelli和Velten，2006年；Marion等人，2008年；Hosein等人，2012年)。虽然低农杆菌密度会产生低转基因表达，但高密度(>OD600=1.0)会导致效率降低(Hosein等人，2012年)、组织变黄或枯萎(Wroblewski等人，2005年)。最佳的细菌密度可以产生更高的转基因表达(Wroblewski等人，2005年；Marion等人，2008年)，而不会对组织造成损害。因此，我们用OD600=0.02、0.2和0.4评估了10天龄玫瑰幼苗在真空渗透过程中的瞬时转化效率。

我们发现细菌密度对玫瑰花转化效率有显著影响(图2)。转化效率与菌体密度呈正相关。OD600=0.02、0.2(参考)和0.4时的平均转化效率分别为24%、100%和177%(图2)。尽管OD600=0.4产生了最高的转化效率，组织损伤很小，但我们在随后的真空渗透中使用了OD600=0.2，以适应两个携带效应子和报告质粒的根癌农杆菌菌株的组合(见“双荧光素酶报告系统是降低实验间变异性的首选标准化策略”和“用ORCA3和ZCT1反式激活玫瑰花STR1启动子”)，这总共导致了测试的最高细菌浓度，OD600=0.4。

图4|VirGN54D和乙酰丁香酮协同促进玫瑰花瞬时转化。用一株根癌农杆菌在OD600=0.2、不加(-)或(+)As的条件下真空渗入10日龄玫瑰花幼苗。根癌农杆菌的报告基因(PSB97)不含VirGN54D基因，或含有VirGN54D基因，位于单独的质粒(pSB97+pAD1289)上，或含有VirGN54D的报告基因(与flc-I报告基因(PSB96)位于同一质粒上)。取样时间为3dpi。将FLAC活性归一化为蛋白质含量。以As处理的幼苗在没有VirGN54D的情况下的平均Fluc活性与蛋白质含量的比值作为参考值(设定为100%)来确定每个样品的相对Fluc活性。实验在三个独立的分析中进行(用+、？、1符号表示)。方框图水平线显示中位数，方框末端显示四分位数范围，小标记显示第10和第90个分位数，胡须显示最低/最高数据点。不同的字母表示显著不同的值(对数转换后的数据进行Tukey-Kramer HSD检验，p<0.05)。

3.3最佳转基因表达发生在感染后3天

转基因表达通常在农杆菌感染后2-4天(Dpi)进行评估(Sparkes等人，2006年；Marion等人，2008年；Wu等人，2014年；Lu等人，2017年)。感染后的长时间培养可能有利于蛋白质或感兴趣的代谢物的积累。因此，我们评估了苗木1，2，3，6和9dpi中的flc活性，以获得表达的时间历程。

检测到最强的FLUC活性为3dpi(图3)。在1dpi时，在低水平可检测到FLOC活性，在3dpi时平均FLOC活性的0.35%(参考文献，100%)。平均FLOC活性在2dpi和3dpi时增加(分别为65%和100%)。在6dpi和9dpi时，FLUC活性分别下降到40%和21%。因此，除非另有说明，否则我们以3 dpi评估所有进一步的实验。

图5|沉默抑制剂HCPro和P19在感染后随着培养时间的延长而增强转基因表达。在OD600=0.2的条件下，用含有FLUC-I报告基因和沉默抑制因子的根癌农杆菌真空渗入相同质粒(TYLCV V2-pSB117，TEV HCPro-pSB118，TBSV P19-pSB116)或对照(tGFP-plus-pSB115)中。分别在3dpi和6dpi采集样本。将FLAC活性归一化为蛋白质含量。以收集3dpi的对照样品(tGFP-plus)的平均FLOC活性与蛋白质含量的比值作为参考(设定为100%)来确定每个样品的相对FLOC活性。实验在三个独立的分析中进行(用+、？、1符号表示)。方框图水平线显示中位数，方框末端显示四分位数范围，小标记显示第10和第90个分位数，胡须显示最低/最高数据点。不同的字母表示3或6 dpi组内显著不同的值(每组的Tukey-Kramer HSD检验，在对数变换的数据上，p<0.05)。 图6|长春花经根癌农杆菌转化后的幼苗。用OD600=0.4(A，B)时缺失编码GUS报告基因的载体或OD600=0.2(pSB161，C)时编码GUS报告基因的载体，用根癌农杆菌真空渗入10d龄的玫瑰花苗，结果表明，在OD600=0.4(A，B)时，根癌农杆菌缺乏编码GUS报告基因的载体，而在OD600=0.2时，含有编码GUS报告基因的载体。取样时间为3dpi。对幼苗(B、C)进行GUS组织化学检测，然后用70%乙醇脱色。

3.4毒力基因的组成性表达增强转基因表达

在农杆菌中，Ti质粒的毒力(Vir)区编码DNA转移到植物所必需的基因。Vir基因的转录受Vira和Virg的调控，以响应植物产生的酚类诱导剂，如乙酰丁香酮(AS)。具体地说，病毒A对病毒的磷酸化导致Vir基因的转录。在突变的VirGN54D中，第54位的天冬酰胺被天冬氨酸取代，导致Virg的诱导活性不依赖于诱导剂(Pazour等人，1992)。通常，AS包括在预诱导和感染步骤中，以驱动VIR基因的表达。本文所用的根癌农杆菌菌株(GV3101)含有编码所有天然毒力基因的pMP90质粒。在本实验中，我们评估了VirGN54D的存在是否可以替代AS或与AS协同作用来提高瞬时转化效率。将VirGN54D编码在与报告基因相同的质粒(PSB96)上，或与报告基因(pSB97+pAD1289)编码在不同的质粒上，电击入GV3101(PMP90)菌株。

VirGN54D和AS均显著提高了玫瑰花的转化效率(图4)。当不存在或在单独的质粒上(不存在且−AS=转化效率为37%；不存在且+AS=100%(参考文献)；分离且−AS=42%；分离且+AS=141%；图4)时，添加AS可提高转化效率。当编码在与报告基因相同的质粒上时，带有AS的VirGN54D获得了最高的转化效率(相同，+AS=220%；图4)。因此，在后续的优化实验中，我们将VirGN54D作为报告基因结合AS添加到同一质粒的骨架中。

3.5沉默抑制因子在感染后长时间培养促进转基因表达

沉默抑制子可以破坏植物固有的RNA沉默机制，因此可以在瞬时转化中随着时间的推移增加转基因表达水平(Pumplin和Voinnet，2013)。我们评价了以下三种沉默抑制剂对月季花瞬时转化效率的影响。烟草蚀刻马铃薯Y病毒(TEV)辅助成分蛋白酶(HCPro)是最早在植物中发现的沉默抑制剂之一(Anandalakshmi等人，1998年；Brigneti等人，1998年；Kasschau和Carrington，1998年)。HCPro通过不完全了解的方式在转录后水平干扰转基因或病毒诱导的RNA沉默(在Voinnet，2001中综述)。番茄丛矮病毒(TBSV)是基因沉默的抑制剂P19(Silhavy等人，2002年)，它与小的21-nt RNA结合，通过诱导MIR168阻止它们在AGO蛋白中的活性，并减少Ago1蛋白的积累(Várallyay等人，2010年)。番茄黄化卷叶病毒(TYLCV)的V2通过与RNA依赖的RNA聚合酶6(RDR6)辅助因子沉默3(SGS3)结合来阻止新的双链RNA合成(Zrachya等人，2007年；Glick等人，2008年)。

在这项研究中，我们比较了这些沉默抑制因子在农杆菌介导的瞬时转化3dpi后对转基因表达的影响，当植物的RNA沉默过程被激活时，长春花苗的瞬时表达方法(“最佳转基因表达发生在感染后3天”)和6dpi。比较了在沉默抑制子(V2，HCPro和P19)存在的情况下，Fluc-I报告基因的表达与不沉默对照(tGFP-plus)的差异。在3dpi时，只有HCPro显著增加FLUC活性(212%)，而不是tGFP-plus(100%，图5)。在6dpi，在没有沉默抑制子的情况下，转基因表达降低。例如，tGFP+对照在6dpi时的FLUC活性是其在3dpi时表达量的38%(与我们在“最佳转基因表达发生在感染后3天”一节中的结果一致)。HCPro和P19在6dpi时显著增强FLUC活性。例如，在6dpi时，FLUC活性是tGFP+对照组的8-11倍(HCPro=310%；P19=446%)。在我们的实验中，沉默抑制剂V2在3或6dpi没有显著增加转基因的表达，似乎不太适合玫瑰花卉系统。因此，我们建议在农杆菌渗透后需要长时间培养(6dpi)的应用中使用HCPro和P19沉默抑制剂。

图7|将归一化报告基因RLUC-I包括在与报告基因Fluc-I相同的质粒上，提供了一致的高RLUC信号，并且与Fluc信号高度相关。用含有：(I)flc-I报告基因(阴性对照-pSB96)，(Ii)同一质粒(相同质粒-pSB167)内的flc-I报告基因和rLUC-I报告基因，(Iii)在不同质粒中的flc-I报告基因和rLUC-I报告基因在不同质粒中的根癌农杆菌(同一菌株，T两质粒-pSB96，pSB165)中，(Iv)在不同质粒和不同菌株中的flc-I报告基因和RLUC-I报告基因，用根癌农杆菌真空渗入根癌农杆菌幼苗(10日龄)，(Iv)在不同质粒和不同菌株的根癌农杆菌中分别使用Fluc-I报告基因和RLUC-I报告基因。在OD600=0.2的条件下，共渗入不同菌株(pSB96、pSB166)的幼苗。取样时间为3dpi。实验是在三个独立的化验中进行的(用蓝色、红色和绿色的线条表示)。对于每个独立的检测，每个样品的FLUC活性被归一化为平均FLUC信号，并且每个样品的RLUC活性被归一化为平均RLUC信号。在每个实验中，对于每个条件，都显示了FLUC和RLUC信号之间的相关性的线性拟合和相应的R平方值。阴影区域表示线性拟合的95%置信区间。

3.6玫瑰花幼苗的转化导致子叶组织化学GUS染色均匀，组织损伤最小。

通过对荧光素酶报告基因的研究，我们在以下条件下获得了最高的转化效率：(1)在OD600=0.2的条件下，用根癌农杆菌GV3101(Pmp90)菌株转化10日龄的幼苗，收获3dpi；(2)将含有内含子报告基因的根癌农杆菌转化到根癌农杆菌，并且同一质粒中的VirGN54D与AS协同激活。

为了确定EASI是否能在幼苗叶片间产生均匀的转化效率，我们用报告基因β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转化幼苗，GUS能酶解X-Gluc产生蓝色沉淀物。该方案在收获时间点将组织损伤降至最低(3dpi，图6A)。在各种植物的特定组织中都能检测到内源β-类葡萄糖醛酸酶(GUS-like)活性(Hu等人，1990年)；但是，我们在缺乏GUS报告基因的根癌农杆菌转化玫瑰幼苗后没有检测到GUS-like活性(图6B)。用含有CaMV2x35S驱动的GUS报告基因的根癌农杆菌幼苗在OD600=0.2进行转化，可以得到均匀的子叶转化(图6C)。因此，我们的EASI方案促进了转基因在玫瑰幼苗子叶中的同源和高表达。

图8|用ORCA3反式激活CroSTR1启动子。用2株根癌农杆菌(体积比为1：1)真空渗入10日龄玫瑰花幼苗：(1)OD600=0.2，含有CroSTR1启动子驱动的FLUC-I报告基因和AtuNOS启动子驱动的RLUC-I归一化报告基因的菌株(质粒pSB137)；(Ii)OD600=0.2，含有CaMV2x35S驱动反式激活基因的菌株(GUS为对照-pSB161或ORCA3-pSB160)。取样时间为3dpi。CroSTR1启动子活性是每个样本的FLOC与RLUC活性比率，归一化为GUS对照的FLOC与RLUC活性比率(设置为100%)。实验在三个独立的分析中进行(用+、？、1符号表示)。方框图水平线显示中位数，方框末端显示四分位数范围，小标记显示第10和第90个分位数，胡须显示最低/最高数据点。不同的字母表示显著不同的值。ORCA3过表达显著增加了STR1启动子的表达(对数转换数据的学生t检验，p<0.0001)。

3.7双荧光素酶报告系统是降低实验间变异性的首选归一化策略

为了准确测量启动子反式激活或启动子活性研究中的表达，需要一个动态范围宽、读出速度快的灵敏报告基因。荧光素酶测定为检测启动子活性提供了高灵敏度和时间分辨率。虽然GUS记者是可视化整个组织表达均匀性的有价值的记者(Ruijter等人，2003年；Koo等人，2007年；Velten等人，2008年)，但GUS有更长的mRNA和蛋白质半衰期，这可能会对启动子活性的解释产生偏差(Ruijter等人，2003年)。因此，我们选择了两种荧光素酶(萤火虫荧光素酶和雷尼拉荧光素酶)来定量启动子活性和归一化转化效率。

FLUC信号与蛋白质含量的归一化已被用来解释组织数量的变化(Ow等人，1986)。为了解释实验中不同幼苗间转化效率的差异，通常使用Renilla荧光素酶(RLUC)的活性来归一化FLUC报告信号。以前的农杆菌介导的瞬时检测通过以下方式对转化信号进行归一化：(1)在同一质粒上(Liu等人，2014；Moyle等人，2017)；(2)在不同质粒上转化到同一农杆菌菌株(Cazzonelli和Velten，2006)；或(3)在不同农杆菌菌株中的不同质粒上并共渗透到幼苗中(V an Moerkercke等人，2011)。为了确定使转化效率标准化的最佳方法，我们使用这三种方法在构成启动子的控制下表达了RLUC-I和FLUC-I(图7)，并确定了两种信号之间的相关性。

在图7中(从左到右)，仅包含FLUC-I的阴性对照(PSB96)没有显示RLUC信号，确认FLUC信号被正确淬灭。将归一化基因(RLUC-I)与报告基因(Fluc-I)包含在同一质粒上，在所有重复实验中，RLUC和FLUC之间始终产生高信号和高相关性(R2从0.65到0.81，图7)。携带归一化基因和报告基因的根癌农杆菌在不同质粒上的渗透苗表现出不同的结果。两株分别携带FLUC-I和RLUC-I的根癌农杆菌共渗幼苗后，FLUC和RLUC信号之间的相关性最小。

因此，我们建议将归一化基因(RLUC-I)与报告基因(Fluc-I)放在同一质粒上，以解释实验中不同幼苗间转化效率的差异。

图9|在反式激活试验中，1部分报告株和6部分效应株的比例提供了最高的灵敏度。用两株根癌农杆菌组合(总OD600=0.4)真空渗透玫瑰花苗(10d龄)：(I)含有CroSTR1启动子驱动的flc-I报告基因和AtuNOS启动子驱动的RLUC-I归一化报告基因的菌株(质粒pSB137)；(Ii)含有CaMV2x35S驱动的反式激活效应子的菌株(GUS作为对照-pSB161或ZCT1-pSB153)。取样时间为3dpi。对于每个报告与效应器比率，CroSTR1启动子活性是每个样本的FLUC与RLUC活性比率，归一化为GUS对照的FLUC与RLUC活性比率(设置为100%)。实验在三个独立的分析中进行(用+、？、1符号表示)。方框图水平线显示中位数，方框末端显示四分位数范围，小标记显示第10和第90个分位数，胡须显示最低/最高数据点。不同的字母表示显著不同的值。ZCT1过表达以1：6的比例显著降低STR1启动子的表达，但在其他比例中不显著(在对数变换的数据上，每个条件与其GUS对照的学生t检验，p<0.05)。

3.8ORCA3和ZCT1对玫瑰花STR1启动子的反式激活作用

接下来，我们应用EASI技术研究了已知的激活剂(ORCA3，van der Fits and Memelink，2000,2001)和阻滞剂(ZCT1，Pauw etal.，2004)对月季花幼苗中CroSTR1启动子的反式激活作用。用两个根癌农杆菌菌株(每个OD600=0.2或最终OD600=0.4)渗入幼苗，一个包含报告构建体，另一个包含效应构建体。报告基因构建由CroSTR1启动子驱动FLUC-I和AtuNOS启动子驱动RLUC-I归一化组成。CroSTR1和AtuNOS启动子在T-DNA上以相反的方向放置，最大化了启动子之间的距离，以避免启动子之间的串扰。效应子结构由CaMV2x35S启动子驱动GUS(阴性对照)、ORCA3或ZCT1组成。以表达GUS的效应子构建为参照，用GUS染色评价转化成功。

与GUS对照的过表达相比，ORCA3的过表达导致了9倍的表达增加(图8)。然而，ZCT1的过表达并没有抑制CroSTR1启动子的活性(图9)。因此，对菌株的比例进行了测试，以优化报告信号和效应器活性(1份报告菌株对应3、6或12份效果株，同时保持最终OD600=0.4)。补充图S2显示归一化基因(RLUC-I)的活性随着效应子与报告分子比率的增加而降低，正如预期的那样。1：3、1：6和1：12的反式激活导致了CroSTR1启动子活性的下降，但RLUC的活性太低，在1：12的比例下不可靠，将在未来的研究中排除(补充图S2)。显示高可靠信号和显著性的比值为1：6。在1：6的比例下，ZCT1的过表达抑制了CroSTR1启动子38%的表达。因此，EASI法是评价月季花启动子活性激活和抑制的有效方法。

4讨论

本文介绍了一种高效的农杆菌介导的幼苗渗透(EASI)转化玫瑰幼苗的方法，并证明了该方法在TIA生物合成基因转录调控研究中的适用性。该方法可用于植物基因功能的快速评估，特别是用于过表达转录因子候选基因和监测TIA生物合成相关基因的表达。我们的EASI方法是对病毒诱导的基因沉默的补充，病毒诱导的基因沉默是用来沉默目标基因的(Liscombe和O‘Connor，2011年)。在此之前，我们开发了一种农杆菌共培养方法来转化玫瑰花叶组织(Weaver等人，2014年)。在这里，我们通过(1)真空渗透，(2)引入具有结构活性的Virg基因，(3)改进了构建设计，对以前的瞬时表达方法进行了彻底的修正和明显的改进，提高了转化效率，具体如下。

4.1真空渗透育苗显着提高转化效率

在所有试验参数中，真空渗透(10日龄)对转基因表达的促进作用最强，比其它苗龄的真空渗透和注射器渗透高18-57倍。其他参数，包括农杆菌密度和最大转基因表达的时间点，转基因表达增加的程度较小，最高可达100%(图2、3)。与注射器渗透相比，V形穴位渗透还具有其他优势，包括易于放大、处理最少，与单个苗木的注射器渗透相比，组织损伤最小(图1)。最大限度地减少组织损伤很重要，因为组织损伤可能会激活应激反应转录因子的表达，并扰乱反式激活结果。

4.2利用组成型活性病毒和沉默抑制子提高转化效率

加入具有结构性活性的Virg(VirGN54D，Pazour等人，1992)也导致表达增加，特别是当突变的Virg基因编码在与报告基因相同的质粒上时。可以将VirGN54D包含在与报告基因相同的质粒上，这需要更低的能量消耗，或者对农杆菌来说压力更小(即，一个带有一种抗生素基因的质粒)在两个不同的质粒上(即，具有两种不同的抗生素耐药性)。此构建物(报告基因和同一质粒上的VirGN54D)与AS添加相结合，获得了最高的转基因表达，比参考条件(VirGN54D缺失，+AS)增加了120%。

通常情况下，瞬时转基因表达量在2-3dpi时很高，但随着培养时间的延长，由于农杆菌感染或转基因沉默导致组织死亡，转基因表达量下降。例如，Zrachya等人。(2007)通过农业渗透转化烟草叶片，在2dpi观察到高水平的转基因(Gfp)，但在7dpi检测不到转基因表达。沉默抑制剂V2、P19和HCPro延长了本氏烟草的转基因表达(Zrachya等人，2007年)。类似地，我们证明HCPro在3dpi时显著提高转基因活性212%，与6dpi时对照相比提高10倍(图5)，而V2在玫瑰花中的沉默抑制作用较弱。

4.3结构设计促进了高表达水平和转化效率的适当标准化

在进行瞬时表达分析时，需要对报告基因的活性进行归一化，以说明转化效率和分析组织数量的潜在差异。报告基因活性通过蛋白质含量的归一化可以解释组织数量的变化，但不能解释转化效率的变化。用各自的报告基因(例如萤火虫荧光素酶和雷尼拉荧光素酶)转化两个不同的根癌农杆菌菌株是最方便的方法，不需要构建复杂的载体。并且质粒可以具有相同的复制来源和抗生素选择标记。不幸的是，我们发现，在这种配置中，总体信号和两个报告基因活动之间的相关性都很低(图7)。另一种方便的方法是用两个不同的载体转化一个根癌农杆菌菌株；这两个载体应该有不同的复制来源，具有不同的不相容组和不同的抗生素耐药性，以便选择包含这两个载体的菌落。虽然在第一次实验中观察到了良好的报告基因表达和相关性(图7；R2=0.823)，但在随后的重复实验中这一趋势并不一致(R2=0.644和0.090)。在同一菌株中加入两个质粒会给农杆菌增加额外的压力，并可能导致质粒拷贝数或T-DNA转移率的变化。

相反，在同一质粒上用报告基因(flc-I)和归一化基因(RLUC-I)设计的结构产生了高信号，并且RLUC和FLUC之间的相关性很高(图7)。因此，我们建议构建一个同时具有两个报告基因的载体，这并不总是一种常见的做法。虽然克隆的范围更广，但构建一个同时含有两个报告基因的载体可以避免同一菌株内两个载体相关的质粒不稳定的风险。此外，Gibson组装(Gibson等人，2009)或基于Golden Gate的方法，如MoClo(Weber等人，2011年)，现在为构建复杂载体提供了易于使用和快速的方法。

4.4EASI在ORCA3和ZCT1反式激活玫瑰花STR1启动子中的应用

为了验证EASI方法的适用性，我们选择了激活因子ORCA3和抑制因子ZCT1对CroSTR1启动子的反式激活和抑制。ORCA3表达诱导CroSTR1启动子活性增加9倍(图8)。这与之前报道的CroSTR1启动子与ORCA3的反激活相当，这导致烟草原生质体的∼增加了10-25倍(V an Moerkercke等人，2015年；Paul等人，2017年)，N.benthamiana叶片的∼增加了2.5倍(V an Moerkercke等人，2015年)。在玫瑰花细胞中，CroSTR1启动子可以被ZCT1抑制(Pauw等人，2004年)。使用含有CroSTR1启动子驱动报告的农杆菌菌株与含有ZCT1效应器的农杆菌菌株的比例为1：1，我们没有观察到任何明显的抑制玫瑰花幼苗的作用(图9)。在维持相对较高的手可靠的报告基因表达。这些结果的情况下，1：6的效应菌效果最好(降低38%)，证明了该方法在研究玫瑰花环菌中TIA生物合成的新转录调控中的应用。

5结论

该方法实现了子叶的均匀高效转化，在月季属植物中具有广泛的应用前景，如研究转录调控和蛋白质定位等。因此，EASI为社区提供了一个及时的工具来快速评估通过可获得的玫瑰花转录组和基因组资源所发现的基因的功能。此外，本研究中构建的载体已通过Addgene提供给其他研究人员，并可用于优化其他植物系统中的瞬时转化和反式激活分析。这些结构包括含内含子的报告基因(用于农杆菌介导的转化)、组成性表达的毒力G基因和沉默抑制子，它们一起可以导致高效的瞬时转化。