2019年哈佛大学的David Liu教授团队在CRISPR基础上开发了对活的生物体做精确基因编辑的方法——Prime editing。从理论上讲，Prime editing编辑能够实现现今所有编辑器的编辑效果。
工作原理：首先，将经过改造的向导RNA（pegRNA）与prime editor蛋白相结合，pegRNA具有双重功能，既能够将编辑蛋白引导到目标位点，又含有编辑的模板序列。prime editor蛋白则由Cas9切口酶和逆转录酶融合而成。在Cas9切割目标位点之后，逆转录酶以pegRNA作为模板进行逆转录，然后将DNA直接聚合到切口的DNA链上。
Prime editing
Prime editing是在传统的CRISPR/Cas9基础上优化的技术，Prime editing由两部分组成，一是nCas9和改造的逆转录酶融合构成的效应蛋白——Cas9-逆转录酶，其二是pegRNA。与普通的gRNA不同，这种pegRNA不但能够结合想要进行编辑的特定DNA区域，还自带“逆转录模板”。Cas9-逆转录酶会在pegRNA的引导下，精准地切开靶标DNA单链，然后根据“逆转录模板”，合成含有正确序列的DNA。细胞内的DNA修复机制会自动把这段新合成的序列整合进基因组。
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Prime Editing技术非常精确，它能够执行高度指定的删除、插入和碱基交换功能。与CRISPR技术下的其他技术最大的不同之处在于：不产生DNA双链断裂（DBS），也不需要DNA模板，就可以非常容易实现定向编辑。
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Prime Editing 技术升级：
PE1
为了减少引入细胞的元件，研究人员将M-MLV逆转录酶与Cas9 H840A切口酶相融合，形成prime editor（PE）。他们还发现方向很重要，将逆转录酶融合到Cas9切口酶的C端可以提高编辑效率。他们将这种复合物成为PE1。
PE1在做单碱基的颠换编辑时，编辑效率是0.7~5.5%。
PE1
PE2
之后，David Liu实验室创建并评估了19种带有RT突变的PE1变异体。这些变异体可提高活性，增强模板与位点的结合，提高持续合成能力或改善热稳定性。最后，他们将Cas9切口酶与M-MLV逆转录酶的五突变体相融合，将其称之为PE2。与PE1相比，PE2在不同位点的编辑效率平均高2.3到5.1倍。
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PE3
prime editing的另一重要元件是向导RNA（pegRNA）。它既是向导RNA，又编码了逆转录的模板。与带切口的基因组DNA链互补的序列可以作为引物结合位点（PBS）。PBS序列与目标位点杂交，并作为逆转录的起始点。
PE3：解离错配的DNA
一旦prime editing在一条链上合成编辑物，那么一条链上的原始序列与另一条链上的编辑序列之间将存在错配。为了指导异源双链的解离以利于编辑，研究人员采用一种之前开发的策略。他们在未编辑的链上引入切口，让细胞利用编辑过的链作为模板来重新合成第二条链。
这种prime editing系统就称为PE3，它还需要另外一条sgRNA。利用这条sgRNA，prime editor复合物将未编辑的链切开（此切口与第一次的切口相距甚远，以避免产生双链断裂），从而将编辑效率提高2到3倍。
通过PE3这个方法，所有12种单碱基的编辑，编辑效率可以达到33%。
Collectively, the prime editing experiments described here performed 19 insertions up to 44 bp, 23 deletions up to 80 bp, 119 point mutations including 83 transversions, and 18 combination edits at 12 endogenous loci in the human and mouse genomes at locations ranging from 3 bp upstream to 29 bp downstream of a PAM without making explicit DSBs.
PE3b
但是，PE3方法往往会同时在DNA的两条链上都引入切口，
PE5
Optimization of pegRNAs
Priming regions with lower G/C content generally required longer PBS sequences, consistent with the energetic requirements of hybridization of the nicked DNA strand to the pegRNA PBS (Fig. 2a).
We recommend starting with a PBS length of about 13 nt, and testing different PBS lengths during optimization, especially if the priming region deviates from about 40–60% G/C content。
我们建议从大约13nt的PBS长度开始，并在优化过程中测试不同的PBS长度，特别是当启动区域偏离约40-60% G/C含量时。
Because many RT template lengths support prime editing, we recommend designing pegRNAs so that the first base of the 3′ extension is not C.
由于许多RT模板长度支持引物编辑，我们建议设计pegrna，使3 '扩展的第一个碱基不是C。
Although the optimal nicking position varied depending on the genomic site (Supplementary Discussion), nicks positioned 3′ of the edit about 40–90 bp from the pegRNA-induced nick generally increased editing efficiency (averaging41%) without excess indel formation (6.8% average indels for the sgRNA with the highest editing efficiency)。
虽然最佳切口位置因基因组位点而异(补充讨论)，位于编辑3 '处的切口距离pegrna诱导的切口约40 - 90bp，通常会提高编辑效率(平均) 41%)没有多余的索引形成(编辑效率最高的sgRNA平均索引为6.8%)
我们建议从距离pegrna介导的缺口约50 bp的非编辑链缺口开始，如果indel频率超过可接受水平，则测试替代缺口位置。
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