MEGAN（Metagenome Analyzer）是宏基因组学进行物种和功能研究的常用软件，实际上现在的Diamond+MEGAN6已经是一套比较完整的物种和功能注释流程了。
image.png
但是由于各种原因，我们在流程中使用的并非最新版。不同版本的MEGAN使用方法差别较大，尤其在命令行模式下。网上的关于这方面的资料也寥寥无几，这里简单记录下使用方法，主要是针对Linux平台的使用。
MEGAN的GUI版相对友好，如果你在Windows平台使用过该软件，那么在Linux上使用和理解起来相对容易些。
MEGAN 4
历史悠久，基本上已经淘汰了。命令行直接配置参数即可，貌似也不要license。
示例如下：
xvfb-run.sh --auto-servernum --server-num=1 \\
MEGAN +g -x \\
"import blastfile=all.blastout_m8.add_taxoid meganfile=all.rma ;\\
recompute toppercent=5;\\
recompute minsupport=1;\\
update;\\
collapse rank=Species;\\
update;\\
select nodes=all;\\
export what=CSV format=readname_taxonid separator=tab file=all.result;\\
update;\\
close"
Megan的参数非常之多，以上仅列出了一些最主要的参数，+g表示开启非图形模式（即命令行模式），-x后接引号内的MEGAN参数，更多可参考MEGAN4 Manual。除了导入、导出之外，其中toppercent表示取比对数目的前百分之多少，minsupport表示至少取一条，collapse表层级折叠，select nodes表示选择方式。命令行中参数是一行一行处理的，所以要加入updates来链接命令。
MEGAN 5
主页download。需要用教育网邮箱注册获取license，将License certificate内容新建一个名为MEGAN5-academic-license.txt的文件保存。命令行使用时通过-L参数来指定它。
另外，MEGAN5需要新建一个参数配置文件，类似MEGAN4中的引号内容，以便MEGAN解析。为避免不同版本的差异，更多参数最好查看MEGAN5 Manual。
例如，制作参数文件command.txt如下：
load taxRefSeqFile='./MEGAN/database/prot_acc2tax-Jul2019X1.abin';
import blastFile=Redtide.blastnr.all fastaFile=Redtide.fa meganFile=tab.rma blastFormat=BlastTAB;
recompute toppercent=5;
recompute minsupport=1;
update;
collapse rank=Species;
update;
select nodes=all;
export what=CSV format=readname_taxonid separator=tab file=tab.result;
update;
quit;
网上有些很旧的资料，如http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=43535加载的是load taxGIFile=gi_taxid_prot.bin文件，但是GI号NCBI已经不再维护了，所以目前这个文件想下都下不到。包括blast比对的结果也不再显示GI号，仅显示accessionID。关于ID的解释，生信技能树有一篇总结比较全面，不了解的可以参考下。比较一下NCBI的blast结果以前的和现在的区别：
7698829-13b768895758e809.png
现在MEGAN官网能下的数据库如下（与MEGAN6共用）：
https://software-ab.informatik.uni-tuebingen.de/download/megan6/welcome.html
image.png
所以在参数文件中务必使用
taxRefSeqFile=参数，而非taxGIFile=。
命令行运行：
xvfb-run.sh --auto-servernum --server-num=1 /software/bin/MEGAN/MEGAN -L MEGAN/MEGAN5-academic-license.txt -g -E -c command.txt
# 或
xvfb-run.sh --auto-servernum --server-num=1 /software/bin/MEGAN/MEGAN -L MEGAN/MEGAN5-academic-license.txt -g -E < command.txt
使用xvfb是为了虚拟化屏幕，在Linux上我们不想要MEGAN显示图形界面，阻止窗口弹出，只要它在运行就行了。不过这个工具如果在你们集群平台上没装，而你又没root权限的话，就得捣鼓半天了。
运行megan这一步一开始生成rma文件，导出后可得到accessionID和taxID的对应关系。
image.png
接下来可以写个脚本通过Taxonomy数据库（下载地址）中的names.dmp和nodes.dmp文件得到物种注释的结果了。
image.png
MEGAN 6
MEGAN6有Community Edition和Ultimate Edition两个版本（download），因为后者需要license key，我试了下社区版的，貌似不支持Linux平台。
$ sh MEGAN_Community_unix_6_17_0.sh
No suitable Java Virtual Machine could be found on your system.
The version of the JVM must be at least 11.
Please define INSTALL4J_JAVA_HOME to point to a suitable JVM.
最终版本的MEGAN6命令行模式后续如果有需求再试试吧，应该和5差不多，因为两者的数据库文件都通用了。具体可参考MEGAN6 Manual。
Ref:
http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzIwNTEwMTUyOQ==&mid=2649693810&idx=2&sn=0264e78fac1dc6ffd3b8a3f6027e3669&chksm=8f2dbec4b85a37d23526e1996837f5f1ebcd41c220dde631855e6d27278c349fc1890ff45aba&scene=4#wechat_redirec
http://megan.informatik.uni-tuebingen.de/t/welcome-to-megan-metagenome-analyzer-community/8
http://blog.sina.com.cn/s/blog_83f77c940102wh7j.html
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1800929/pdf/377.pdf
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