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细胞培养(换液/传代/冻存/复苏)操作说明

细胞培养(换液/传代/冻存/复苏)操作说明

作者: HyCyte海星 | 来源:发表于2022-06-01 14:00 被阅读0次

    | 细胞换液 

    所需试剂

    细胞完全培养基:★ 推荐使用海星生物细胞配套专用培养基

    1. 细胞处理后的第二天,在显微镜下观察细胞状态,如死细胞较多且细胞密度较低,需要进行换液操作。

      (1)悬浮细胞请在高倍镜下观察,一般而言,活细胞轮廓圆润、界限清晰、透明度大、折光性强。如细胞活率较高,则继续正常培养。

      (2)贴壁细胞如观察到较多细胞漂浮,请在高倍镜下观察,判断漂浮着的细胞是死细胞还是暂未贴壁的活细胞。如细胞活率较高,则继续正常培养。

      (3)半贴壁细胞正常培养会有部分细胞漂浮,属正常现象。请在高倍镜下观察,判断漂浮着的细胞是否是死细胞。如细胞活率较高,则继续正常培养。

    2. 如需换液,参考以下步骤:

     (1)悬浮细胞:收集培养容器中的所有细胞悬液。250 g离心4 min后弃去上清。使用预热的完全培养基重悬,将细胞悬液接种到合适的培养容器中。

     (2)贴壁细胞:直接弃去培养容器中的上清,添加预热的完全培养基至原培养容器中。

     (3)半贴壁细胞:收集培养容器上清中的所有细胞,250 g离心4 min后弃去上清。使用预热的完全培养基重悬,接种至原培养容器中。

    3. 之后,每2~3天更换一次完全培养基,后续根据细胞生长密度和状态传代或冻存。

     注意: 若发现异常情况,应及时排查原因,并与我们联系。

    | 细胞传代 

    所需试剂

    细胞完全培养基

    贴壁和半贴壁细胞需要同时准备以下试剂:

    0.25% Trypsin-0.04% EDTA(货号: GUTP-R001,以下简称胰酶)

    1×PBS(货号: GUPB-R001,以下简称PBS)

    1. 预热完全培养基(贴壁和半贴壁细胞还需要预热胰酶和PBS)。

    2. 细胞收集。

     (1)悬浮细胞直接收集培养容器中的所有细胞悬液至离心管中。

     (2)贴壁/半贴壁细胞需要对细胞进行消化处理,步骤如下:

             ① 用PBS洗涤细胞2次。洗涤过程中注意动作轻柔,清洗全面。

             贴壁细胞直接弃去培养容器中的培养上清。用PBS洗涤细胞2次,洗涤后的PBS直接弃去,无需保留。

             半贴壁细胞需收集培养容器中的培养上清至离心管中。用PBS洗涤细胞2次,洗涤后的PBS需收集至离心管中。

            ② 加入胰酶,迅速铺匀,确保其充分接触细胞表面。

            ③ 显微镜下观察消化情况,约70%~80%细胞收缩变圆后,轻拍培养容器外壁,使细胞脱离培养容器底面。立即加入胰酶双倍体积的完全培养基,轻摇培养容器,使培养基和胰酶迅速混匀,终止消化。

            ④ 吸取细胞悬液,吹打培养容器底面数次,尽可能将细胞都吹打下来。将细胞悬液转移至离心管中。

    3. PBS洗涤培养容器1~2次,收集所有细胞悬液至离心管中。

    4. 收集的所有细胞悬液250 g离心4 min。

    5. 离心后去除上清。加入2 mL预热的完全培养基,轻柔吹打细胞沉淀,充分吹散、混匀。

    6. 将细胞按(2.5~4.0) ×10^4个活细胞/cm2接种至适宜的培养容器内。

    注意: 如未计数,也可按照适宜比例进行传代,但请根据细胞实际生长情况灵活调整传代比例。

    7. 摇匀细胞,将培养容器放入细胞培养箱中。

    8. 后续根据细胞生长密度和状态进行补液(悬浮细胞)/换液(贴壁/半贴壁细胞)、传   代或冻存等操作。

    | 细胞冻存 

    所需试剂

    冻存液

    ★ 推荐使用海星HyCyte™一步冻存液(即用型、无血清、无需程序降温)

    货号:GUCP-R201

    1. 待细胞生长至可传代的密度,即可准备冻存。

    2. 消化细胞,取少量细胞悬液计数。细胞悬液经250 g离心4 min。

    3. 离心后去除上清,用适量4℃预冷的冻存液重悬细胞。将细胞按比例或数量分装至冻存管中。一般冻存密度为(1.0~2.0)×10^6个/mL。

     注意: 细胞长时间在非培养条件下放置会严重影响细胞的状态。如离心后用冻存液重悬计数,请将细胞放置于4℃冰箱内,以减弱细胞代谢,较好的保持细胞状态。

    4. 如使用海星一步冻存液,冻存管直接竖直放入-80℃冰箱即可完成“一步”冻存。如使用程序冻存液,需将冻存管放入提前预冷的程序降温盒后放入-80℃冰箱。

    5. 24小时后可将冻存管转移到液氮进行长期保存。

        注意: 细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议24 h后尽快转移至液氮中。

    | 细胞复苏 

    所需试剂

    细胞完全培养基

    ★ 推荐使用海星生物细胞配套专用培养基

    1. 开启37℃水浴锅。预热完全培养基,提前将细胞从液氮中取出,放于-80℃冰箱,让冻存管中液氮挥发。

    2. 洁净工作台内准备15 mL离心管,加入5 mL预热的完全培养基。

    3. 从-80℃冰箱中取出细胞。快速将冻存管置于37℃水浴锅内,快速晃动,使冻存液迅速融化。

        注意: ① 融化过程必须晃动冻存管,保证冻存液融化均匀。晃动时应避免水没过管盖增加污染风险。

                 ② 管内冻存液融化至只剩一个约2mm直径的冰晶时,可停止水浴。继续晃动冻存管至冰晶融化。

    4. 用75%酒精消毒冻存管表面。在洁净工作台内小心开盖,尽量避免气泡溢出,轻柔吹打数次,转移至预先准备的离心管内。用少量完全培养基洗涤冻存管1~2次,一并收集至离心管内。

    5. 250 g离心4 min。离心后去除上清。加入2 mL完全培养基,轻柔吹打细胞沉淀,充分吹散、混匀。(如有台盼蓝可取少量细胞悬液进行染色计数)

    6. 将细胞平均接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中,加入足量完全培养基,摇匀细胞,将培养容器放入培养箱中培养。

    7. 复苏次日,观察细胞状态并换液,具体操作见”细胞换液”。

        注意: 贴壁/半贴壁细胞接种24 h内不应扰动。部分细胞贴壁较慢,复苏后48 h不应扰动,具体注意事项见相应细胞说明书。

    细胞处理原则

    · 严格的无菌环境。务必保证实验室、超净台/生物安全柜和培养箱的清洁。

    · 规范的操作方式。请按照操作说明描述的方式操作,注意操作细节。

    · 需要合适的、质量可靠的实验耗材和试剂。使用的试剂必须经验证可靠,适宜细胞生长且批间差异小。

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