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技术介绍
几十年来，重亚硫酸盐转化已成为甲基化测序的行业金标准，该技术可以检测DNA水平上被修饰的C(胞嘧啶)：5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。然而，这项技术有诸多一直没法克服的缺点：刺激（harsh）的化学反应使得大部分DNA发生降解，由此，测序后序列复杂性大大降低（complexity），该技术是将未甲基化的C转换为T，然而，未甲基化的C占人类基因组的95%左右，重亚硫酸盐转化建库后，碱基就会极度不平衡，因此，对后续二代测序质量也有很大影响，不得不谨慎考虑如何混库才能保证下机数据质量。
本文介绍了一种新的甲基化检测技术TAPS(TET-assisted pyridine borane sequencing)，该技术摆脱了重亚硫酸盐转化，则是反其道而行之，直接将甲基化的C转化为T，进行测序。该技术结合酶学和化学反应完成C到T的转化，首先通过TET1氧化酶将5mC和5hmC氧化成5caC(5-羧基胞嘧啶)，然后在还原剂吡啶硼烷（Pyridine borane）的作用下，转变成DHU(二氢尿嘧啶)，DHU可以作为PCR模板，被能识别U的DNA聚合酶识别，因此，通过PCR过程，最后生成了C转化为T的PCR产物。
TAPS技术优势：1. 对DNA无破坏性，丢失的DNA减少，测序数据的复杂性或覆盖度就会提高。转化之后，可以保留10kb的DNA片段，对三代测序也会有很好的应用。2. 由于是将甲基化的C转变为T,因此对DNA序列的碱基平衡影响极小，下机数据质量提高，数据比对率明显提高。3. TAPS技术的成本比传统的重亚硫酸盐转化方法要低很多。
技术路线
生物专业很是百搭，生物与物理，生物与数学，生物与计算机，生物与化学，都能碰撞出精彩的火花。TAPS技术在成型的过程中也主要是在解决化学反应的问题。先来看几个化学式：
吡啶硼烷（Pyridine borane）能将5fC(5-甲酰胞嘧啶)和5caC(5-羧基胞嘧啶)转化为DHU，未被甲基化的C，5mC(5-甲基胞嘧啶)和5hmC(5-羟甲基胞嘧啶)则不被转化，但是5fC和5caC在基因组中含量极少，而5mC和5hmC的含量却是5fC和5caC的10到100倍。这也是大部分甲基化检测位点是5mC和5hmC的原因，因此引入了TET1氧化酶。
TET1氧化酶能将5mC和5hmC氧化成5caC，而5caC能够被吡啶硼烷还原为DHU,这样，就可以通过间接地方法将5mC和5hmC转化为T，并进行测序了。基于以上原理，作者又做了进一步延伸。可以有针对性的只检测5mC或5hmC,通过两种block方法，分别将5mC和5hmC block掉。作者用β-葡糖基转移酶(β-glucosyltransferase）标记5hmC，使得吡啶硼烷还原5gmC，而作者直接用化学氧化剂高钌酸钾（KRuO4）只将5hmC氧化为5fC，流程图如下：
BOX1:
2018年10月8日，同样发表在Nature Biotechnology上的，Bisulfite free的甲基化检测技术，ACE Seq(APOBEC-coupled epigenetic sequencing)，同样也是运用酶学的方法对甲基化的C进行检测。本文中同样引入了β-葡糖基转移酶(β-glucosyltransferase）保护5hmC，进而通过脱氨酶进行脱氨反应，使未甲基化的C和5mC转换为U。由于本技术仅能检测5hmC，而且5hmC在体内的含量并未占有很大比例，因此，最终得到的信息有限。
与重亚硫酸盐转化法的比较
1. 转化效率
作者得到了两种TET1，一种来自那氏虫属Naegleria，NgTET1，另一种来自属的TET1，mTET1，通过实验验证，mTET1的转化效率稍好一些。
作者用含有5个mCpG，长222bp的序列进行了转化效率的预估。选取内切酶TaqI的识别序列（TCGA）作为目标序列，其中C进行甲基化修饰，流程如下图。
作者进一步检测了TET1对mESC基因组DNA的转化效率，在E14 mESC中5mC占98.5%，5hmC占1.5%，5fC和5caC极其微量。实验结果显示，TET1氧化反应以后，96%的C被氧化为5caC，3%的C被氧化为5fC，吡啶硼烷处理后，大于99%的被修饰的C转变为DHU。
2. PCR效率及偏好性
DNA聚合酶以DHU作为底物，是否会影响PCR的效率呢？作者利用自合成的两端序列，退火延伸后，一条链上有一个5mC，其互补链上有5hmC，选用多种DNA聚合酶进行了PCR和Sanger 测序验证，除不能识别U的DNA聚合酶，如KAPA HiFi polymerase, NEB Q5 polymerase,Phusion polymerase之外，其余的多个聚合酶都能顺利的进行PCR。
作者进一步通过qPCR验证了DHU的扩增效率，从数值上看，与T和C并没有明显的差异。
3. DNA破坏程度
重亚硫酸盐最致命的弱点是对DNA有极大的损伤，>90%的DNA会发生降解，变成单链（ssDNA）。本文通过针对不同大小的DNA片段分别进行TAPS以及Bisulfite 处理，从电泳图上看出，TAPS技术对DNA并没有明显的损伤，而Bisulfite处理导致显著的DNA降解。
基于此，作者验证了不同长度对C-T的转化效率的影响。同样选取内切酶TaqI的识别序列（TCGA）作为目标序列，从胶图预估，转化效率接近100%。
Bisulfite 转化后，DNA变为单链，文库构建也有一定难度。TET1和吡啶硼烷转化后，DNA仍保持双链，可直接进行PCR。
4. 数据质量
Bisulfite转化使得碱基严重失衡，进而导致测序数据质量明显下降。TAPS技术并没有导致明显的GC含量发生变化，因此，测序数据质量有明显的提升。
在TAPS 和 WGBS(whole-genome bisulfite sequencing) 的对比试验设计中，以E14 mESC基因组DNA为材料，加入了全部甲基化的Lambda DNA评估假阴性率（甲基化的C未得到转化），加入了没有甲基化的2kb的扩增子评估假阳性率（未甲基化的C被转化为T）,加入了自合成的同时包含5mC和5hmC的序列，两侧为随机碱基(N5mCNNand N5hmCNN)，评估5mC和5hmC在不同序列中的转化效率。
结果显示，5mC的转化效率为96.5%（Lambda DNA）和97.3%(spike-ins)，因此，假阴性率为3.5%和2.7%。5hmC的转化效率为89.1%，CpG unit转化效率高于非CpG。假阳性率为0.23%。
TAPS的覆盖度比WGBS高，检出的CpG位点也高于WGBS。此外，上述对比测序的DNA起始量也有所不同，TAPS起始量为100ng，WGBS起始量为200ng。
TAPS还适用于更低的起始量，1ng，因此，对检测cell free DNA 的甲基化是非常好的选择。由于TAPS兼容低起始量和长读长，TAPS在单细胞领域和三代测序领域也会有很好的应用。
文中说TAPS可以取代WGBS，这个结论是否能够成为现实，还需要后续更多技术上和参数上的对比。或许在不久的将来，Bisulfite 转化会退出历史舞台，而DNA甲基化测序有了新的环境和技术，肿瘤早筛，基因检测等领域也会得到更好的发展。
参考资料:
https://doi.org/10.1038/s41587-019-0041-2
https://doi.org/10.1038/nbt.4204
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