随着全基因组测序成本的不断下降，细菌分类相关方法也从DNA-DNA hybridization（DDH）这类实验性方法转移到基于基因组序列的相似性值（overall genome relatedness indices, ORGI）计算上。
平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）是一种与DDH相似的ORGI。
1. ANI（Goris et al., 2007）
如何通过ANI衡量两个菌株的相关性呢？
假设现在有两个菌株A和B，对应基因组为genome A和genome B。
鬼画符般的ANI流程
A->B的ANI和B->A的ANI不一定是一致的，一般取两者的平均值作为A-B的最终ANI。
2.OrthoANI（Lee et al., 2016）
A->B的ANI和B->A的ANI不一定是一致的，之间的差异甚至显著高于1%。为了解决这一问题，学者提出了OrthoANI。其中，考虑了orthology。
具体流程分为三步：
1⃣️将两个基因组序列都切成长1020bp的连续性片段。短于1020bp的片段会被舍弃。
2⃣️用BLASTn程序搜索这些片段的相似性片段。
3⃣️只有互为最佳best hit的片段才能成为orthologous fragments。
a. 从中选择长度长于35%（1020bp*35%）的比对。
该比对中两片段(A'和B')的平均核苷酸一致性：
b. 基因组范围的核苷酸一致性 = 所有orthologous片段一致性的平均值。
OrthoANI流程
相关软件：OrthoANIu tool
3. ANI和OrthoANI的比较
- 两者的相关性非常高，R^2=0.9998
- OrthoANI略高于ANI（大约0.1%）
- species相关阈值均为：95%～96%
- OrthoANI运行速度要高于ANI，可能更适合大规模比较分析
- 两者均不太适用远缘物种
4. 相关信息
- 1020bp的来源：DDH实验中，DNA片段约长1000bp，为了取一个近似，选择1020bp。那为什么不选1000bp呢？🤦♀️
- BLASTn和MUMMER都可以计算ANI。当物种亲缘关系比较近时，ANIb和ANIm有很好的相关性，ANIm会更快。但当亲缘关系比较远时，ANIb具有更好的效果（Li et al., 2015）。
参考文献：
- Goris, J., Konstantinidis, K.T., Klappenbach, J.A., Coenye, T., Vandamme, P., and Tiedje, J.M. (2007). DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole-genome sequence similarities. Int J Syst Evol Micr 57, 81-91.
- Lee, I., Kim, Y.O., Park, S.C., and Chun, J. (2016). OrthoANI: An improved algorithm and software for calculating average nucleotide identity. Int J Syst Evol Micr 66, 1100-1103.
- Li, X., Huang, Y.J., and Whitman, W.B. (2015). The relationship of the whole genome sequence identity to DNA hybridization varies between genera of prokaryotes. Anton Leeuw Int J G 107, 241-249.
5. pyani使用
我下载的是0.2版本的，所以参看0.2版本教程
# 1. 创建并进入一个新的conda环境
conda create -n pyani python=3.8
source activate pyani
# 2. 安装pyani
pip3 install pyani
# 3. 使用
average_nucleotide_identity.py -i test/ -o testout/ -m ANIm -g # mummer，仅使用近缘物种
average_nucleotide_identity.py -i test/ -o testout/ -m ANIb -g # blast
ANIm有时候会报错，还没找到原因。个人比较偏向使用ANIb。
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