密码子优化

  在大肠杆菌中进行异源蛋白质的表达时，有时会发现重组蛋白质的表达量很低，给后面的分离纯化造成很大的困难。有些技术人员可能比较困惑，表达的蛋白质不是毒蛋白，载体是商用载体，一般商用载体的启动子效率都很高，这也排除了转录水平低的问题。那为什么蛋白质表达水平还那么低，这种情况你就要考虑是不是密码子偏性的问题。
  什么是密码子偏性呢？可以这么理解，宿主经过千百万年的进化，密码子与反密码子之间已经形成了一个平衡，有些密码子出现的频率高，其对应的tRNA水平也就高，密码子频率低对应的tRNA水平也就低。如果插入的外源基因上携带大量在宿主中频率很低的密码子，那么对应的tRNA就会出现不够用的情况，宿主首先要保证自身的蛋白质合成，剩下的才能用于异源蛋白质的合成，虽然宿主可以提高tRNA的水平，但对于异源蛋白质来说，合成的晚了或者慢了，就会引起翻译过程一系列的连锁减慢，合成的效率就会严重下降。
  基于这一原理，要提高某一基因在异源宿主中的表达量，常用的策略之一就是将目的基因的稀有密码子进行同义替换，使之更接近于宿主细胞的密码子使用方式。通过这种方法，提高外源基因在大肠杆菌宿主中表达量的报道已有很多。

外源型β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)(一种补充稀有密码子对应tRNA的大肠杆菌宿主)中的表达情况 [1]陈荫楠, 刘震, 石贤爱, et al. 密码子优化提高多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶异源表达量[J]. 中国生物化学与分子生物学报(4):101-109.
我硕士期间做的一个研究内容，以多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶为例，分析了密码子偏性程度并提出密码子替换的方式。感兴趣的同学可以找到该文献看一看。
[2]Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J. Codon bias and heterologous protein expression[J]. Trends in biotechnology, 2004, 22(7): 346-353.
这是一篇密码子偏性与异源蛋白表达的综述，对密码子偏性理论，密码子优化方式，密码子优化成果做了总结，很有参考价值。

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  我这里制作了一个大肠杆菌所有密码子偏好的数据集，表中RSCU代表该密码子在所有同意密码子中的相对概率，计算方法为: [该密码子出现频率] / [同义密码子概率的和] × 同义密码子个数。可以根据密码子RSCU判断其偏性，进行密码子替换时，将RSCU值低的密码子替换成值高的密码子即可提高异源蛋白的表达量。

密码子	氨基酸	RSCU	密码子	氨基酸	RSCU	密码子	氨基酸	RSCU	密码子	氨基酸	RSCU
UUU	Phe F	1.15	UCU	Ser S	0.87	UAU	Tyr Y	1.14	UGU	Cys C	0.89
UUC	Phe F	0.85	UCC	Ser S	0.89	UAC	Tyr Y	0.86	UGC	Cys C	1.11
UUA	Leu L	0.78	UCA	Ser S	0.73	UAA	Stop	1.94	UGA	Stop	0.87
UUG	Leu L	0.77	UCG	Ser S	0.93	UAG	Stop	0.19	UGG	Trp W	1.00
CUU	Leu L	0.62	CCU	Pro P	0.63	CAU	His H	1.14	CGU	Arg R	2.28
CUC	Leu L	0.63	CCC	Pro P	0.50	CAC	His H	0.86	CGC	Arg R	2.42
CUA	Leu L	0.21	CCA	Pro P	0.76	CAA	Gln Q	0.69	CGA	Arg R	0.38
CUG	Leu L	2.99	CCG	Pro P	2.11	CAG	Gln Q	1.31	CGG	Arg R	0.59
AUU	Ile I	1.53	ACU	Thr T	0.66	AAU	Asn N	0.90	AGU	Ser S	0.90
AUC	Ile I	1.26	ACC	Thr T	1.75	AAC	Asn N	1.10	AGC	Ser S	1.67
AUA	Ile I	0.21	ACA	Thr T	0.51	AAA	Lys K	1.53	AGA	Arg R	0.22
AUG	Met M	1.00	ACG	Thr T	1.07	AAG	Lys K	0.47	AGG	Arg R	0.12
GUU	Val V	1.03	GCU	Ala A	0.64	GAU	Asp D	1.26	GGU	Gly G	1.35
GUC	Val V	0.87	GCC	Ala A	1.08	GAC	Asp D	0.74	GGC	Gly G	1.62
GUA	Val V	0.62	GCA	Ala A	0.85	GAA	Glu E	1.38	GGA	Gly G	0.43
GUG	Val V	1.49	GCG	Ala A	1.43	GAG	Glu E	0.62	GGG	Gly G	0.60

同时，也给出两个做密码子优化的网页工具：OPTIMIZER 和 Jcat。Optimizer进行密码子优化时会考虑GC含量、密码子平衡（如果将全部低频密码子换成最高频密码子，会导致细菌表达压力过大，不利于自身生长，这也是不行的），还可行规避酶切位点，自己指定参考集等，功能强大，推荐使用该工具。Jcat简单粗暴，直接将低频密码子替换成高频密码子。如果你只有蛋白质序列可以使用我自己编写的一个工具：http://www.liuzhen106.com/tools/103_2.html。
  什么进化压力导致了密码子使用偏性，还没有定论。一些研究者推断，密码子偏性能够减少同工tRNAs的多样性，一些稀有密码子的tRNAs含量较少，有利于生物在快速生长条件下节约部分能量，从而降低了新陈代谢负荷。不管是什么原因导致了密码子偏性，但密码子偏性对异源蛋白表达水平确有深远的影响。