凌恩生物合作客户河海大学李轶课题组于《Science of the Total Environment》期刊发表“Tidal flat aquaculture pollution governs sedimentary antibiotic resistance gene profiles but not bacterial community based on metagenomic data”研究文章，揭示了环境参数对ARGs的影响，并确定了江苏盐城两个地区潮滩水产养殖沉积物中决定抗菌素耐药性的生态过程的影响。
期刊：Science of the Total Environment
影响因子：10.753
发表时间：2022
样本类型：水体、沉积物
客户单位：河海大学
一、研究背景
沿海潮汐滩是陆地和海洋环境的交叉区域，被认为是人为活动（例如渔业和水产养殖）污染物的储存库。具体来说，沿海水产养殖环境中抗生素和抗生素抗性性基因（ARGs）的流行对河口生态系统构成了严重威胁。然而，在潮滩区，水产养殖对ARGs和群落的发生和丰富程度的贡献尚未得到充分的探索。
二、实验设计
本研究是在中国江苏省盐城市的沿海潮滩水产养殖区进行。从射阳潮滩水产养殖区（序号：SY1-SY7）和东台潮滩水产养殖区（序号：DT1-DT7和RE；32°55′-33°84′N，120°95′-120°42′E）中共选择15个采样点（图1）。分别在各个采样点采集水体和沉积物样本，进行理化性质的测定，以及沉积物中的抗生素含量的测定。
利用宏基因组测序方法研究了江苏潮滩水产养殖区中ARGs的丰度及其与细菌群落和环境参数之间的关系。
图1 研究区域和采样点分布
三、实验结果
1、潮滩水产养殖区ARGs的分布
对水体和沉积物样本理化参数测定结果表明，射阳县SY1-SY7采样点的理化参数低于东台市DT1-DT7采样点（P≤0.05）。这些结果符合实际的水产养殖环境。
所有沉积物样品的抗生素浓度测定范围从未检测到（nd）到35.50 ng/g dw。9种目标抗生素中有8种在水产养殖沉积物样本中被鉴定出来（图2）。RE采样点的氧氟沙星（OFX）和磺胺嘧啶（SDZ）抗生素浓度及其其他参数（如TN、TP）均超过了其他采样点的相应值。因此，选择RE位点作为参考样本进行进一步分析。
图2 水产养殖潮滩沉积物中的抗生素残留物
作者使用宏基因组和CARD数据库分析了潮滩水产养殖区的ARG丰度和抗生素耐药类型。总共有247个ARG亚型与33个ARGs类型相关。最突出的ARG类型是赋予肽类、糖肽、β-内酰胺、异烟肼、氨基糖苷类、利福霉素、莫匹罗星、梭链孢酸钠和氟喹诺酮类药物抗性的基因（图3(a)）。其中大多数与人类和动物常用的抗生素有关。
最丰富的ARGs被确定为macB、tetA（48）、evgS、walK、bcrA、fusA、pvrR和rpoC（从最多到最少）。这些基因贡献了约60%的总ARG丰度，约30%的基因以100%的检测频率普遍存在。
与射阳潮滩样品相比，东台潮滩区的总ARG丰度也表现出更高的水平（P < 0.05）。基于Bray-Curtis方法的PCoA结果表明，地理区域是抗生素耐药类型的主要解释变量（解释51.2%的方差）（图3(c)）。
图3 水产养殖潮滩带沉积物中ARGs的特性研究
2、细菌群落与ARGs之间的关联
宏基因组测序结果表明，在所有沉积物样品中，变形菌门（66.26%）为优势门，其次是放线菌门（15.35%）、黄杆菌门（3.25%）等（图4(a)）。RE采样点的优势细菌门与其他采样点不同，例如拟杆菌门的相对丰度最高。
在两个研究区域的门水平上，PCoA分析表明细菌组成存在显著差异（图4(b)）。这些结果与所有样品的ARG丰度特征一致（图3(c)）。RDA分析结果表明，抗生素、盐度和TOC作为环境影响因素与RE、DT2和ST1样品中的细菌群落和丰度有关。而SY2、SY4、SY5、DT3、DT6与TOC呈正相关，与pH呈负相关。此外，TN与潮滩水产养殖区细菌群落的相关性较弱（图4(c)）。
图4 水产养殖潮滩沉积物细菌群落和多样性特征
通过网络分析确定了细菌群落（前50个属）和ARGs关联网络图，从而分析ARGs潜在的细菌宿主。东台潮滩养殖基地（图5(a)）的网络分析结果得到79个节点和320条边，射阳场地有81个节点和321条边（图5(b)）。东台地区和射阳地区的网络模块化指数分别为0.631和0.551，表明这些网络具有较强的模块化结构。
Paraburkholderia、寡养单胞菌属、假单胞菌、Draconibacterium、中慢生根瘤菌属与ARG类型呈显著相关性（图5(a)）。其中，Paraburkholderia、寡养单胞菌属、假单胞菌是 Fucidin（如vanH、vanS）、磷霉素（如GlpT、PtsI）、肽类（如mprF、liaS）和利福霉素（如rpoB）抗性基因的细菌宿主。中慢生根瘤菌属被确定为该区域抗生素外排泵的细菌宿主，揭示了其在环境中潜在水平基因转移的能力。
图5 基于（a）射阳和（b）东台养殖潮滩，细菌OTUs与ARG类的共发生网络图
3、携带ARGs的致病菌
本研究在属和种水平上，对所有沉积物样品分别获得了1939个属和7923个种。1939个细菌属大多属于变形菌门。基于CARD细菌病原体数据库，所有样本共鉴定出21种高于90%相似性的潜在病原体。鉴定出10株最丰富的病原菌，与临床相关抗菌素耐药性相关。
macB（大环内酯类抗性基因）和tetA（四环素抗性基因）被确定为最丰富的ARGs，分别与本研究中的淋病奈瑟菌和嗜麦芽窄食单胞菌相关。
4、ARG群落生态构建过程
本研究采用中性模型来定量理解随机过程在确定ARG群落和细菌群落组装模式中的重要性。中性模型成功地拟合了细菌类群的发生频率和类群相对丰度的变异性之间的大部分关联，解释了91.7%的群落方差（图6）。这表明，随机过程在细菌群落构建中的贡献很大。
与细菌群落相比，对于ARG群落，中性模型不能拟合ARG的发生频率。这说明随机过程在ARG群落构建中并没有起主导作用（图6(b)）。基于零模型分析结果显示，异质性环境选择（75.00%）构成了潮滩水养殖环境中ARG群落聚集的生态机制基础。这表明，确定性过程有助于形成本研究中ARGs的群落构建。
图6 细菌群落和ARG群落的生态过程
四、研究结论
综上所述，本研究利用宏基因组组装分析，研究了沿海生态系统中ARGs及其相关细菌群落生态过程的分布。研究结果揭示了环境参数对ARGs的影响，并确定了江苏盐城两个地区潮滩水产养殖沉积物中决定抗菌素耐药性的生态过程的影响。主要结论如下：
（1）沉积物样品中抗生素浓度为nd～35.50 ng/g dw，东台潮滩抗生素污染较射阳潮滩严重。
（2）宏基因组结果表明，在所有样本中，共有247个与ARG 33个类型相关的ARG亚型被表征，其在东台地区的丰度超过射阳地区。
（3）同时，潮滩水产养殖中的21种细菌被鉴定为携带ARG的病原体，包括大肠杆菌、河流弧菌和金黄色葡萄球菌。
（4）采用中性和零模型分析确定群落生态过程，结果显示细菌群落和ARG群落一般分别以随机过程和确定性过程为主。
参考文献
Tidal flat aquaculture pollution governs sedimentary antibiotic resistance gene profiles but not bacterial community based on metagenomic data. Science of the Total Environment, 2022.
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