2022-08-19

Nat Rev | 癌症中的染色体外DNA扩增

原创 huacishu 图灵基因 2022-08-19 10:13 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学机制

撰文：huacishu

IF=59.581

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

1、作者讨论了目前对ecDNA的结构以及它如何促进癌基因表达的理解，包括与ecDNA染色质组织和核定位相关的属性；

2、作者描述了检测和测序ecDNA的新工具的开发及其在癌症中鉴定ecDNA结构和丰度的用途；

3、作者讨论了ecDNA染色质组织的改变及其对癌基因调控的影响，提示这些新的ecDNA特性可能会产生意想不到的致癌功能，这可能为治疗干预提供了机会。

美国杰克逊基因医学实验室Roel G. W. Verhaak教授课题组在国际知名期刊Nat Rev Genet在线发表题为“Extrachromosomal DNA amplifications in cancer”的论文。染色体外DNA（ecDNA）扩增是癌症改变的重要驱动因素。ecDNA的功能与其独特的性质有关，例如其圆形结构与染色质化和表观遗传调控景观的改变有关，以及其在细胞分裂期间随机分离的能力，这增加了细胞间拷贝数的异质性。

在这篇综述中，作者综述了目前已知的ecDNA是如何生成的，以及其遗传和表观遗传结构如何影响癌症中原癌基因的调控。作者还讨论了最近发现的ecDNA功能如何影响肿瘤发生，强调其可以作为癌症新的治疗靶点。

原癌基因异常高表达是肿瘤发生的标志，它可由染色体结构或数目异常引起。体细胞拷贝数改变是癌基因表达变化的最常见驱动因素。染色体外DNA（ecDNA）是一种环状DNA元件，已成为体细胞拷贝数扩增的最重要形式之一。自1965年在神经母细胞瘤细胞系中发现ecDNA以来，在大规模DNA测序数据集中对ecDNA的重新评估表明，它存在于大多数癌症类型中（图1a）。与其他类型的局灶性扩增相比，含有ecDNA的肿瘤患者的临床结果更差，这证实了ecDNA元素的功能重要性。

两个普遍接受的特征使ecDNA成为原癌基因扩增的独特且异常有效的载体。首先，它们的圆形结构与转录升高相关，与线性扩增相比，导致原癌基因表达增加。其次，摆脱了染色体位置限制和缺少着丝粒，ecDNA不平等地分离到子细胞中，这可以快速增加ecDNA拷贝数并驱动肿瘤内异质性（图1b）。因此，ecDNA代表了具有独特分子特征的癌症中癌基因扩增的重要载体，其中大多数目前尚未完全了解。

在这篇综述中，作者讨论了目前对ecDNA的结构以及它如何促进癌基因表达的理解，包括与ecDNA染色质组织和核定位相关的属性。描述了检测和测序ecDNA的新工具的开发及其在癌症中鉴定ecDNA结构和丰度的用途。讨论了ecDNA染色质组织的改变及其对癌基因调控的影响，作者认为，这些新的ecDNA特性可能会产生意想不到的致癌功能，这可能为治疗干预提供了机会。

ecDNA的结构性质

合成和扩增

当产生的染色体异常包含原癌基因或为细胞提供增殖或生存优势的致癌调节元件时，就会发生克隆选择。据报道，至少有70个基因组区域在癌症中被反复扩增，包括含有原癌基因的位点，如EGFR、MYC、MYCN和CCND2。在癌症中以高拷贝数水平进行局部扩增的大多数基因在肿瘤子集中被染色体外扩增，在所有新诊断和未治疗的癌症中有14%检测到ecDNAs（图1a）。一些ecDNA只包含增强子而不包含基因，这表明选择含有ecDNA的肿瘤细胞可以基于ecDNA的作用，而不仅仅是激活癌基因表达。

由于基因组中随机位置的DNA损伤以及错误修复，可能会出现局部扩增。在其最简单的形式中，ecDNA元件由通过端到端连接循环的两个DNA双链断裂产生的单个染色体DNA片段组成（图2）。更常见的是，ecDNA由来自不同染色体的数十到数百个分离的DNA片段组成，重组成单个元素（图2）。复杂的ecDNA结构形成至少与两种机制有关：第一，染色体破碎，产生聚集重排并导致ecDNA形成，在原发性癌症中检测到的约36%的ecDNA中，染色体三联体的足迹证明了这一点；第二，断裂-融合-桥循环（BFB），如在一些ecDNA上发现的头对头折回反转所证明（图2）。

分布

ecDNA分子的数量因细胞而异，这意味着有丝分裂期间ecDNA的分离不均匀（图1b）。ecDNAs中没有着丝粒，在细胞周期的中期无丝分裂阶段，通过纺锤体复合力阻止了均匀的有丝分裂分布。然而，如果有丝分裂后子细胞的细胞核中不包含ecDNA元素，它们就会被微核所包裹。因此，需要存在确保有丝分裂ecDNA分布的机制。ecDNA在S期早期复制，这一特性通常与活性转录相关（图3）。在DNA复制开始时，ecDNA分子从核周边重新定位到核中心，这可能意味着存在ecDNA特异性复制机制。在M期和分离期间，ecDNA优先结合线性染色体的端粒区域。

在患者肿瘤中已观察到适应性反应，其中含ecDNA的亚克隆在靶向治疗下迅速缩小，但在治疗压力消除后重新出现。在应激条件下，动态降低和增加ecDNA水平的能力可能特别有效，其中可能包括肿瘤微环境中遇到的缺氧和高酸度。表观遗传状态与应激反应相关，可促进EGFR位点的瞬时位点特异性拷贝数增加，特别是在染色体外时。在稳定的环境下，如细胞培养中，ecDNA通常会丢失，因此ecDNA的优势可能较小。因此，即使ecDNA在每个细胞周期复制一次，它也不遵循大多数有丝分裂遗传规则，使肿瘤能够快速进化并保持高度的遗传异质性。

ecDNA的转录调控

染色质组织

最近的证据表明，与染色体DNA相比，ecDNA具有增加的染色质可及性和较不紧凑的核体组织的特点（图4a）。与肿瘤样品中的线性扩增子相比，在染色体外环形扩增子中观察到转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）测定的信号更高，并对DNA拷贝数进行归一化。在髓母细胞瘤肿瘤中证实了循环和扩增位点内ATAC-seq信号密度的增加。作者观察到，与同源线性DNA的染色质相比，ecDNA上的染色质平均可接近性高出两倍，80%的ecDNA区域高度可接近。

总的来说，ecDNA上的基因区域比它们的线性对应部分更容易接近。染色质可接近性的增加导致ecDNA cargo基因表达水平的增加，这显著高于基于ecDNA拷贝数的预期。驱动ecDNA上染色质可及性增加的机制目前尚不清楚。

增强子共扩增

ecDNA的圆形结构导致染色质元素的三维重新定向，从而实现局部和远端增强子-基因接触（图4b）。除了过去的报告表明扩增子边界是由DNA脆弱位点形成的之外，最近的研究还提供了证据，证明在癌细胞起源类型中活性的共扩增邻近增强子元件在形成扩增子边界中起主要作用。

在神经母细胞瘤中，基于局部增强子的存在或不存在，描述了两类不同的扩增子。I类扩增子结合了局部增强子元件，结构简单，很少结合来自其他染色体的额外远端DNA片段。相比之下，II类扩增子缺乏局部增强子共扩增，但通过连接来自远处位点的DNA片段进行补偿。共扩增的远距离DNA片段含有谱系特异性增强子元件和绝缘体，形成具有新的空间相互作用调控邻域的高度复杂的多片段扩增子。共扩增调控元件及其与癌基因启动子的接触不仅保留在ecDNA上，而且积极促进癌基因表达和癌细胞适合性。

总之，ecDNA中癌基因的表达仅部分由ecDNA上癌基因剂量的增加决定。将这些新的见解整合到ecDNA驱动的癌基因去调控的统一模型中，该模型将包括局部和远处增强子强度、染色质紧密程度和可接近性、增强子结合位点处的转录因子亲和力和DNA拷贝数之间的相互作用，这些共同决定了ecDNA的转录输出。

ecDNA枢纽

在间期，细胞核在空间上被组织成一个分区结构，转录活性位点向核内部聚集。富含RNA聚合酶II（RNAPII）的核室充当转录工厂。ecDNA的转录激活状态可能有助于ecDNA簇的形成，并表明ecDNA利用类似原理形成核聚集体，并可能与其他ecDNA共享转录机制（图5a）。

溴脱氧核糖核酸和末端外结构域4（BRD4）蛋白积累在转录活性调控元件上以促进基因表达，在ecDNA中枢形成中起着重要作用。BRD4抑制是依赖于癌基因MYC的癌症的一种治疗策略，有趣的是，ecDNA阳性细胞中BRD4的抑制导致了含有ecDNA的MYC和编码其他基因的ecDNA的中枢的分散，以及减少cargo基因表达。尽管相对于线性基因组而言，单个ecDNA分子和ecDNA枢纽优先与RNAPII相关，但在ecDNA枢纽中RNAPII分子相对更丰富，进一步证实了ecDNA枢纽在转录调控中的作用。RNAPII的抑制不会破坏ecDNA中枢，这表明RNAPII可能在其形成后被招募到ecDNA。

综上所述，这些结果表明，ecDNA中枢是生物学上相关的核体，在癌基因的转录调节中发挥作用，因此可能影响癌症的维持和进展。

反式转录调控

ecDNA还与线性基因组物理接触，特别是与转录活跃的染色体区域，这反映在ecDNA-染色体相互作用组中RNAPII和H3K27ac信号的富集上。因此，与未连接到ecDNA的区域相比，具有高ecDNA-染色体接触频率的区域的基因表达增加（图5b）。因此，共扩增ecDNA增强子调节同一ecDNA上癌基因的调节功能可能延伸到染色体基因，尤其是癌基因。

ecDNAs作为移动增强子的这一有趣的新兴功能创造了转录的合成非整倍体效应，与整个染色体或染色体臂的拷贝数增加如何增加所有常驻基因的表达水平相当。它还为为什么ecDNA通常包含非编码染色体DNA提供了额外的解释，并可能解释了仅包含调控元件而不包含基因的ecDNA的反调控功能。此外，这种反式激活剂模型提供了一种次要但潜在重要的机制，通过该机制ecDNA可以在染色体转录水平上快速促进肿瘤内异质性。然而，ecDNA与特定染色体区域的亲和力以及ecDNA-染色体相互作用组形成的详细过程仍有待发现。

结论和展望

治疗靶向的机会

许多致癌基因通过扩增被激活，包括癌细胞中特有的外周DNA。主要的治疗策略是直接抑制这些扩增癌基因的蛋白产物。这种方法对于编码蛋白激酶的癌基因尤其成功。例子包括用于治疗HER2阳性乳腺癌的抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗，以及被批准用于治疗携带EGFR扩增的非小细胞肺癌的小分子阿法替尼。然而，大多数通过局部扩增激活的癌基因，包括ecDNA，不是激酶。

长期以来，以MYC、TERT和MCL1等频繁扩增的基因为靶点一直被认为是遥不可及的。干扰ecDNA的维持、传播、结构或功能可提供抑制癌基因激活的机会，甚至可防止ecDNA介导的靶向治疗耐药性。在理想情况下，单一药物有可能改善多种癌症类型的预后，而不管扩增的癌基因是什么，只要结构是染色体外的。ecDNA的独特特征—它们的复制、分离、聚集成中心、微核的发生和排出—提供了至少五种潜在的治疗策略，如下文所述和图6所示。

策略1：靶向ecDNA复制

DNA复制始于双螺旋被螺旋酶解旋。有95种人类DNA螺旋酶，每种都具有DNA或RNA结构特异性。ecDNA复制可能受到独特的螺旋酶活性的影响，如通过特定螺旋酶进行线粒体DNA复制。另一种选择包括干扰脱氧核糖核酸三磷酸DNA的从头合成，以限制核苷酸生产。核糖核苷酸还原酶是染色体DNA复制的限速酶，可以使用吉西他滨或羟基脲作为靶点。ecDNA特异性复制酶是否存在目前尚不清楚。

策略2：针对ecDNA分离

复制后，ecDNA可能在染色体DNA上分离到子细胞。目前尚不清楚是什么使ecDNA能够附着到染色体上。更好地理解ecDNA分离可能提供了调节该过程的机会。

策略3：将ecDNA集群定位到中心

特定的ecDNA功能，如ecDNA中枢形成，可能在药理学上受到干扰，从而降低ecDNA cargo的转录和活性，例如通过靶向BET蛋白BRD4。

策略4：以ecDNA为靶点

显色三倍体和其他DNA断裂事件后的DNA修复导致ecDNA形成。DNA损伤修复过程的扰动，如同源重组和非同源末端连接，可能对受益于ecDNA扩增的肿瘤不利，并可能与其他DNA损伤治疗（如放疗）结合最有效。

策略5：靶向ecDNA微核

最后，通过目前未知的分子机制，ecDNA比染色体DNA更容易被微核排出和消除，羟基脲也促进了这一过程。微核化可能会阻止捕获的ecDNA的DNA修复，从而使ecDNA容易受到电离辐射等DNA损伤策略的影响。对参与微核排出的分子途径的深入分析可能揭示新的治疗靶点。

治疗性ecDNA靶向的挑战

尽管ecDNA导向的药物开发有机遇，但仍存在一些复杂因素：

首先，很明显，它们在大小和结构复杂性等不同性质上有所不同。这种分子异质性可能意味着需要不同的策略来靶向ecDNA的不同亚类；

第二个潜在的复杂因素是我们关于ecDNA克隆性的数据有限。与酪氨酸激酶抑制剂类似，靶向亚克隆ecDNA可为缺乏ecDNA的细胞创造生长优势，并推动快速克隆选择和治疗抗性；

第三，目前对ecDNAs重新整合到基因组的能力缺乏了解。整合可能随机发生在DNA损伤部位，这提供了另一条可能限制治疗效果的轨迹，因为ecDNA可能作为耐药性机制重新整合，然后在治疗取消后重新出现在染色体外；

最后，靶向位于细胞核中的分子需要能够穿过多个细胞膜和内体逃逸，从而增加了化学生物学的复杂性。填补这些知识空白对于最大限度地实现成功的抗ecDNA治疗至关重要。由于多种机制可能有助于ecDNA的生成、维持和进化，因此本综述中讨论的单一机制可能不足以成功治疗携带癌症的ecDNA。

此外，鉴于癌症的异质性，一刀切的方法可能无法奏效，ecDNA驱动的癌症亚类对上述治疗方法的敏感性不同。然而，作者认为降低ecDNA频率可以降低ecDNA驱动的治疗抵抗风险，从而提高治疗效果，最终延长患者生存期。

见解

正如作者所指出的，人们在表征外周DNA的独特序列和染色质组成方面取得了重要进展。关于这些特性的许多问题仍然没有答案。例如，导致ecDNA上染色质紧密性改变的分子机制仍然未知，ecDNA与其他ecDNA和染色体DNA的相互作用是如何形成的。未来对这些机制的研究不仅有可能揭示新的生物学特性，还可能揭示可能作为治疗靶点的因素。

此外，使用新的单细胞方法进行的研究有望对ecDNA细胞间异质性和结构-功能关系产生重要的新见解。最后，许多其他有机体，如酵母和其他有机体也含有环状DNA，在维持、染色质调节和复制等特性方面可能部分类似于ecDNA，这表明关于癌症中ecDNA的一些悬而未决的问题可能只能通过多模型系统中的跨学科研究方法来解决。因此，为了充分发挥ecDNA的潜力，改善ecDNA驱动的癌症患者的治疗和诊断，需要对ecDNA相关研究进行持续的研究。

教授介绍

Roel Verhaak博士是杰克逊基因组医学实验室的计算生物学教授和副主任。他参与并共同领导了癌症基因组图谱（TCGA）的胶质瘤项目，同时在哈佛大学和麻省理工学院以及德克萨斯大学安德森癌症中心工作，这项工作有助于提高我们对这种致命脑瘤的认识。他是最早认识到癌症中染色体外DNA扩增的频率和潜力的人之一。Roel的研究主要集中在脑肿瘤上，主要利用对空前规模和复杂性的数据集的计算分析。Roel的研究重点是分析癌症基因组数据，以提高我们对癌症生物学的理解。他对理解脑肿瘤的疾病进展以及研究染色体外DNA扩增在癌症中的作用有着专门的研究兴趣。他的团队将功能建模的方法与大型数据集和计算方法相结合。

参考文献

Yi E, Chamorro González R, Henssen AG, Verhaak RGW. Extrachromosomal DNA amplifications in cancer. Nat Rev Genet. 2022;10.1038/s41576-022-00521-5. doi:10.1038/s41576-022-00521-5