OneStepWGCNA
今天发现TBtools上有了个神器 Rserver 。这意味我们可以把别人写好的R脚本直接拿过来运行。于是用OneStepWGCNA这个插件试验一下。本文主要记录试验过程和可能遇到的一些问题，主要参考『TBtools-plugin』OneStepWGCNA插件这篇文章。想要了解WGCNA的具体含义和流程可以参考：
WGCNA分析，简单全面的最新教程
一文学会WGCNA分析
WGCNA官方网站WGCNA算法研究笔记
OneStepWGCNA 的准备文件和详细参数

虽然题目有点标题党，但这个插件真的方便，真的感谢这个插件的作者。

工具准备

TBtools
Rserver: 需要在TBtools的用户群里下载，一共181M，相当于一个独立的R环境，具体安装方法参考Rserver 插件 for TBtools。用户群可以在公众号：生信药丸里找到。
OneStepWGCNA插件：可以在TBtools的plugin store下载到。建议先下载plugin store里的plugin store at high speed。因为在plugin store里下载插件太慢了，太慢了，太慢了。

数据准备

OneStepWGCNA 的输入文件是基因表达矩阵和表型数据（或样品分类数据）。这里用了RED数据库里的284个日本晴的不同部位，不同处理的表达矩阵(FPKM数据)。样品分类数据用每个样品取的组织。

表达矩阵
样品分类数据

第一次跑的时候遇到的坑

报错信息

第一次包发现GenomeInfoDb这个包没下下来，R文件里也没有申明需要这个包。我在TBtools的插件目录下OneStepWGCNA的R脚本里加上了：

if (!require('GenomeInfoDb')) install.packages('GenomeInfoDb')

R文件

再跑一次就成功了
这个TBtools插件文件夹位置一般在C:\Users\names\ .TBtools.Plugin\OneStepWGCNA

OneStepWGCNA 参数详解

readcount or fpkm 是表达矩阵，以Tab为分割符，行是样本，列是基因。
Trait data 是表型文件或分类文件，可以有多个表型，可以是连续性也可以是离散。如果要把多分类性状和连续性状都混到一起，可以把多分类性状转为one-hot编码，这个用下excel就能完成。

one-hot编码

Expression data 是表达矩阵数据类型，count数据是不能直接用来做WGCNA的
Normalization method 是表达矩阵转换的方式，如果是count数据可以选varianceStabilizingTransformation或log10(CPM+1)，如果是FPKM可以选rawFPKM，不经过转换，和取对数。建议都试试，看看哪个效果更好。
RcCutoff 是用来除噪声的，我看原作者的教程里大概意思是count推荐10，FPKM推荐0.2，当然，这个参数还是要随着测序深度和具体生物学问题而改变的。
samplePerc 和上面的参数配对的，在0-1之间，如果是0.5，RcCutoff 是0.2 代表想要 50%的样品的FPKM>0.2。
RemainGeneNum 是保留多少基因进行WGCNA，写0或小于0就是啥都没了，会报错。
mergeCutHeight 是合并模块的阈值， 0.25的意思就是把相关系数大于0.75的模块合并。
minModuleSize 是指最少一个模块要包含30个基因。

输出结果

Sample_clustering 样品聚类结果

样品聚类结果

这里如果出现明显的离群样本，记住样本的名字，在表达矩阵和trait矩阵中删掉对应样本再跑一次

软阈值筛选
绿线为0.8，这里没有筛的很好的阈值，就选了经验阈值14来做power进行后续计算。
模块的邻接矩阵特征向量相关性

一共找到了10个模块，该结果主要反应模块间的相关性。

模块划分
表型与模块的关联
发现棕色模块和根的相关性最高，其他种子，花药，穗的部位都没有找到相关性高的模块。一个可能是由于这几个部位的样本量少，另一方面本身不同处理对表达量的影响也很大。这里只是试一试，并不能反应真实的科学结论。
基因对应的模块
可以拿表型关联上的模块做后续的分析，如GO，KEGG啥的，巧的是富集分析也能用TBtools做。

最后再唠叨两句

我发现最后结果里还有很多信息没有被存下来，我想看选几个基因画TOM图，或者画个网络图，或者是图的字体太小了，看不清想重新画，该咋办？
最粗暴的办法还是把整个网络保存下来，想要啥，自己整。

修改了下blockwiseModules的参数，把TOM和net都保存下来
以下代码主要来源于 WGCNA分析，简单全面的最新教程

library(WGCNA)
#把存入的Rdata都读进来，总能用上的 \xk one_traits是我设的Title name,要改
load("00.one_traits.datatraitbase.Rdata")
load("00.one_traits.net.Rdata")
load("00.one_traits.datatraitbase.Rdata")
load("00one_traits.Modular.Rdata")
load("one_traits.tom-block.1.RData")
Title<-"one_traits"
###TOM图
moduleColors = labels2colors(net$colors)
TOM <- as.matrix(TOM)
dissTOM = 1-TOM
# Transform dissTOM with a power to make moderately strong 
# connections more visible in the heatmap
plotTOM = dissTOM^7
# Set diagonal to NA for a nicer plot
diag(plotTOM) = NA
# Call the plot function
# 这一部分特别耗时，行列同时做层级聚类
TOMplot(plotTOM, net$dendrograms, moduleColors, 
        main = "Network heatmap plot, all genes")

###导出Cytoscape 图格式
probes = colnames(datExpr)
dimnames(TOM) <- list(probes, probes)
# Export the network into edge and node list files Cytoscape can read
# threshold 默认为0.5, 可以根据自己的需要调整，也可以都导出后在
# cytoscape中再调整
cyt = exportNetworkToCytoscape(TOM,
             edgeFile = paste(Title, ".edges.txt", sep=""),
             nodeFile = paste(Title, ".nodes.txt", sep=""),
             weighted = TRUE, threshold = 0.5,
             nodeNames = probes, nodeAttr = moduleColors)

## 模块内基因与表型数据关联
#关联样品性状的二元变量时，设置
robustY = ifelse(corType=="pearson",T,F)
if (corType=="pearsoon") {
  geneModuleMembership = as.data.frame(cor(datExpr, MEs_col, use = "p"))
  MMPvalue = as.data.frame(corPvalueStudent(
             as.matrix(geneModuleMembership), nSamples))
} else {
  geneModuleMembershipA = bicorAndPvalue(datExpr, MEs_col, robustY=robustY)
  geneModuleMembership = geneModuleMembershipA$bicor
  MMPvalue   = geneModuleMembershipA$p
}
# 计算性状与基因的相关性矩阵
## 只有连续型性状才能进行计算，如果是离散变量，在构建样品表时就转为0-1矩阵。
traitData<-read.table(traitsfile,header=T,sep='\t') #traitsfile 表型文件
if (corType=="pearsoon") {
  geneTraitCor = as.data.frame(cor(datExpr, traitData, use = "p"))
  geneTraitP = as.data.frame(corPvalueStudent(
             as.matrix(geneTraitCor), nSamples))
} else {
  geneTraitCorA = bicorAndPvalue(datExpr, traitData, robustY=robustY)
  geneTraitCor = as.data.frame(geneTraitCorA$bicor)
  geneTraitP   = as.data.frame(geneTraitCorA$p)
}

## Warning in bicor(x, y, use = use, ...): bicor: zero MAD in variable 'y'.
## Pearson correlation was used for individual columns with zero (or missing)
## MAD.

# 最后把两个相关性矩阵联合起来,指定感兴趣模块进行分析
module = "brown"#感兴趣的模块
pheno = "Root" #感兴趣的性状
modNames = substring(colnames(MEs_col), 3)
# 获取关注的列
module_column = match(module, modNames)
pheno_column = match(pheno,colnames(traitData))
# 获取模块内的基因
moduleGenes = moduleColors == module

# 与性状高度相关的基因，也是与性状相关的模型的关键基因
verboseScatterplot(abs(geneModuleMembership[moduleGenes, module_column]),
                   abs(geneTraitCor[moduleGenes, pheno_column]),
                   xlab = paste("Module Membership in", module, "module"),
                   ylab = paste("Gene significance for", pheno),
                   main = paste("Module membership vs. gene significance\n"),
                   cex.main = 1.2, cex.lab = 1.2, cex.axis = 1.2, col = module)

10000个基因的TOM
棕色模块与根的相关性