一个超简单的转录组项目全过程--iMac+RNA-Seq（二）Q

前期文章

一个超简单的转录组项目全过程--iMac+RNA-Seq（一）

Q1: 在上一期中，有人问到：为什么不能用toplevel的参考基因组。

其实我是没什么想法，只是简单的认为toplevel有50G，很多内容是用不上的。一般情况下，大家都只用primary参考基因组（3个G），并且妥妥的够用，文章中也是这么写的。我真的相当的得过且过，只要不影响后续，多一点都不想学了，好偷懒。然而，我可以偷懒是因为，总是有很多大神在帮助我，我太嘚瑟啦！

image.png

所以我决定附上这一部分细节内容，我不产生知识，我只是知识的搬运工。

image.png

Q2. 样本量的设计要合理

这是我的补充，方案和实验设计，才是整个课题的核心。建议每一个group一定要做n≥3的生物学重复。不然这个结果就很容易被视为，藐视统计学知识。

进入正题

2 Quality Control

2.1 准备工作

## 先把样本的文件名都放在一个叫做sample.txt的文件内
ls *fastq.gz  ## 查看目前的样本名字,举例样式如下 
1_negative_R1.fastq.gz
1_negative_R2.fastq.gz
2_dox_R1.fastq.gz
2_dox_R2.fastq.gz
## 尽量简化样本名

## 学习一下cut的用法
## usage: cut -b list [-n] [file ...] 
##        cut -c list [file ...]
##        cut -f list [-s] [-d delim] [file ...]
ls *fastq.gz | cut -d '.' -f 1
ls *fastq.gz | cut -d '.' -f 1 | uniq
ls *fastq.gz | cut -d '_' -f 1,2,3
ls *fastq.gz | cut -d '_' -f 1,2
## 尝试了两种分割方法，确定下面这种
ls *fastq.gz | cut -d '_' -f 1,2 | uniq
# 1_negative_R1
# 1_negative_R2
# 2_dox_R1
# 2_dox_R2
ls *fastq.gz | cut -d '_' -f 1,2 | uniq > samples.txt

2.2 用vim创建一个叫做qc.sh的脚本

vim qc.sh  ## vim创建qc.sh

########### 写入以下内容

#!/bin/bash
set -e
set -u
set -o pipefail

#source activate rna
samples=$1
dir="clean"  ## 相对路径，因为我的qc.sh是在fa文件的文件夹内。

mkdir -p $dir

cat $samples | while read id
do
    fq1=${id}_R1.fastq.gz
    fq2=${id}_R2.fastq.gz
    trim_galore -q 25 --phred33 --length 36 -e 0.1 --stringency 3 \
        --paired -o $dir $fq1 $fq2

done

#source deactivate

2.3 运行脚本

nohup bash qc.sh &

2.4 multiQC

ls /Users/project/clean/*gz | xargs fastqc -t 14
multiqc ./

2.5 查看报告

质控报告会产生多达十项内容，通常网上有很多对于质控报告每一个项目的内容解读，需要自行查看，不再赘述。

本章小结

需要掌握的知识点有：

1. 什么是质控，质控的目的是什么？
2. 质控报告解读，质控成功的标准是什么？
3. 什么是脚本，如何运行脚本？
4. 待补充。

关于脚本的知识可以查阅：如何写一个脚本（附送一个脚本）

网上大多数的质控报告解读文章，只告诉我们哪一项是什么意思，大概要什么标准，但不容易找到关于这样问题的答案：我们的数据，到底至少要达到什么程度，才能继续往下走，我想这才是我们最需要理解的关键。

因此，我又得到了一个小锦囊（作为“伸手党”的一员，我还是相当幸福的）：

ENCODE 标准
https://www.encodeproject.org/data-standards/

image.png