环状DNA的复制

环状DNA有两种复制方式，一种是从复制起点开始双向复制，生成两个DNA双链，然后分开，符合半保留复制的机制，细菌的基因组就是采用这种复制方式。另一种是滚环状复制，以双链DNA中的一条链为模板，在另一条DNA链的3'端延伸，生成多拷贝或单拷贝的DNA单链，DNA单链或经过互补配对形成双链，然后切割、成环；或切割、成环后，再形成双链。噬菌体基因组采用滚环式复制方式。

1. 复制叉式复制

细菌基因组通常是单一的环状复制子，从唯一的起始点启动双向复制。Figure 10.5展示了细菌环状DNA的复制方式。大肠杆菌起始位点oriC的长度为245bp。在起始点启动复制后，两个复制叉沿着相反方向前进。在这一阶段的环状染色体由于其特殊外表像希腊字母θ，有时被称为θ结构。环状结构的结果就是复制过程完成后会产生两条相连的染色体，因为一条染色体穿过了另一条染色体（这也称为链接），这就需要特定的酶系统去分开它们。

两个复制叉通常在圆环的半途相遇，但是如果他们速度不同，先到达ter位点的一个会停止前进，等待后到的复制叉。

2. 滚环式复制

这是噬菌体中常见的DNA复制方式[1]。滚环式复制的一个特点是以一条环状单链DNA为模板，进行新的DNA环状分子合成。噬菌体的双链DNA环状分子先在一条单链的复制起点上产生一个切口（nick），然后以另一条单链为模板不断地合成新的单链。释放出的新合成的单链或是先复制成双链DNA，被酶切割成单位长度后，再形成环状双链DNA分子；或是释放出的新合成的单链DNA，先被酶切成单位长度形成单链环状DNA分子后再复制成双链环状DNA分子。见FIGURE 12.5, 12.6和12.7。

Figure 12.5 The rolling circle generates a multimeric single stranded tail

3. 滚环被用来复制噬菌体基因组[2]

滚环式复制在噬菌体中是很常见的。基因组单元可以从被取代的尾部上切割下来，产生单体，可以包装进入噬菌体颗粒内，也可用于下一步的复制循环。FIGURE 12.8更详细的描述了以滚环复制为主的噬菌体复制模式。

噬菌体X174由一个单链环状DNA组成，这条链称为正（+）链。合成的互补链称为负（-）链。产生双链体环的行为如图12.8的上部所示，随后，这个双链DNA通过滚环进行复制。

双链体环转化成一种共价闭合形式，随后形成超螺旋。由噬菌体基因组编码的A蛋白，在双链DNA正链的特定位点上产生缺口，这一位点就被定义为复制起始点。切开复制起始点之后，A蛋白与切口产生的5'端保持连接的状态，而其3'端则在DNA聚合酶作用下延伸。

DNA的结构在该反应中具有重要作用，因为DNA只有在负超螺旋状态下才能被切割（在空间中以双螺旋手性的相反方向，围绕双螺旋的轴进行缠绕）A蛋白需要结合到围绕切口位点的单链十联体DNA片段。这说明需要超螺旋帮助才能形成单链区，为A蛋白提供结合位点。（具有能够切割双链DNA并且能与释放出的5'端相结合的酶活性蛋白称为松弛酶（relaxase））。切口产生了一个3‘-羟基端和一个5'-磷酸端（与A蛋白共价连接），这两个末端在phiX174噬菌体的复制中都发挥作用。

利用滚环机制，切口的3’-羟基端延伸为一条新链。新链围绕着环状（-）链模板延伸，直至到达起始位置，并置换起始点。在这里A蛋白又再次实现其功能。它仍然与滚环和被替代链的尾部5‘端连接，因此它又回到起始点的成长点附近。所以同一个A蛋白再次识别起始点并进行切割，继而连接到新切割产生的末端上，理论上，这可无限的、周而复始的循环进行下去。

缺口形成后，被置换的（+）单链以环状形式释放，A蛋白则参与环化事件。事实上，（+）链产物的3’端和5‘端的连接由A蛋白完成，这是A蛋白在整个反应中的一部分：在每个复制周期末尾释放，并启动下一轮循环。

4. 质粒的滚环复制

质粒与上述噬菌体的复制方式类似，也采用滚环复制的方式，如下图所示，但质粒本身为DNA双链。

General mechanism of plasmid rolling-circle replication (RCR) [3]

(Step I) A supercoiled plasmid containing the double-strand origin (dso) and single-strand origin (sso) is the substrate for DNA replication and is first nicked by a RepC dimer. A secondary structure at the dso facilitates binding and/or nicking of the DNA by RepC which becomes covalently attached to the 5′-P end of the DNA after nicking. (Step II) PcrA helicase interacts with RepC and unwinds the duplex DNA displacing the leading strand of the plasmid and leaving a free 3′-OH end at the dso. (Step III) DNA polymerase III loads at the free 3′end and synthesize a new leading strand. The displaced leading strand is protected by SSB proteins. (Step IV) A covalently closed single-stranded DNA is produced that can be subsequently converted to dsDNA which involves the synthesis of an RNA primer at the sso by the RNA polymerase followed by DNA synthesis by DNA polymerases I and III.

参考资料

1. 现代遗传学（第二版），赵寿元，乔守怡

2. LEWIN’S GENES XII，JOCELYN E. KREBS，ELLIOTT S. GOLDSTEIN，STEPHEN T. KILPATRICK

3.Pastrana, Cesar & Carrasco Pulido, Carolina & Akhtar, Parvez & Leuba, Sanford & Khan, Saleem & Moreno-Herrero, Fernando. (2016). Force and twist dependence of RepC nicking activity on torsionally-constrained DNA molecules. Nucleic Acids Research. 44. gkw689. 10.1093/nar/gkw689.