文献解读 | LncRNA经典研究思路

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今天这篇文献主要是

介绍INcRNA功能的原理和原因

论文：The how and why of lncRNA function: An innate immune perspective(INcRNA功能的原理和原因：先天免疫视角）

文章来源 | 非编码RNA研究园地（公众号ID:ZKQF-RNA)

摘要

下一代测序为人类转录体的组成提供了一个更完整的图像，表明大部分“蓝图”是大量不被理解的非蛋白质编码转录本。这包括新发现的一类基因，称为长非编码RNA(IncRNAs)。

由于不同物种的印度RNA缺乏序列保守性，这意味着它们在生物学上的重要性最初受到了一些怀疑。IncRNAs通过与蛋白质、RNA、DNA的相互作用或这些相互作用的组合来介导它们的功能。它们的功能通常由它们的定位、序列和/或二级结构决定。

在这里，我们提供了一个典型的方法，以研究这些基因的复杂性，重点是最近发现的先天免疫领域采取的方法。最后，我们讨论了挑战，以及新技术的出现，这些新技术将继续推动这一领域的发展，并能更深入地了解这类基因的生物学重要性。本文是Kotb Abdelmohsen编辑的题为：控制基因表达的ncRNA专刊的一部分。

导言

虽然编码基因在免疫细胞功能中的作用已被很好地描述，但是incRNAs在这些过程中的作用才刚刚开始显现。在这里，我们以巨噬细胞激活的生物模型系统为框架，展示了我们如何研究INcRNA生物学。

我们提供了一个循序渐进的指南，供我们在研究INcRNAs时参考.此外，我们还讨论了挑战，以及新技术的出现，这些新技术正在帮助我们研究这些基因的方式。

INcRNA的分类和分子功能

（A)根据它们相对于邻近蛋白质编码基因的基因组位置分类：双向的、基因间的、反义的、内含子的、增强子的、感重叠的。

（B)图的左下角代表了如何转录调节INcRNA的活动。转录激活被描述为基本的“第一部分”，以及在刺激模式识别受体（PRR）后的炎症激活“第二部分”期间。三个incRNA例子基因显示了A、B和C。

第三部分描述了INcRNA如何经历差异的异构体表达，这是共同调控的。在激活转录过程中，INcRNA可以进行差异剪接，也可以利用炎症刺激后新的转录起始位点，如脂多糖（LPS)。INcRNA的转录后调控分为三个部分：IV、V和VI。转录完成后，一个INcRNA可以经历几个过程。

第四部分描述RNA修饰，它可以改变INcRNA分子的结构。这些修饰可以根据细胞的炎症状态添加或删除。

第五部分描述了miRNA的生物发生过程，其中一个incRNA可以被加工成一个成熟的miRNA。

第六部分表明，如果一个INcRNA有一个小的开放阅读框（SmORF),它也可以被翻译。

（C)图的右下角显示了INcRNA在细胞核和细胞质中的调节功能。在活化转录（基本为I部分或炎症II部分）过程中，INcRNA可以抑制基因（mRNA基因A和C)或激活基因（mRNA基因A和B)。

IncRNA可以是转录因子增强活化的支架，也可以是染色质重构蛋白打开或关闭染色质的支架。INcRNA还可以通过影响稳定性、改变剪接活性、修改修改或甚至影响成熟mRNA的上限来调节mRNA转录的转录第三部分。

另外，INcRNA可以作为miRNA海绵，间接抑制miRNAs靶向mRNA的表达。最后，在翻译过程中，INcRNA可以通过与核糖体或mRNA转录体结合来调节mRNA的翻译。

INcRNA的表达操控

(A)RNA干扰作用于翻译后，在细胞质中降解转录本。(B)Gapmers是由RNA和~10 nt DNA序列的核心片段组成的，对RNase H通路起关键作用。

(C)CRISPRI使用与KRAB结构域融合的CaS 9催化非活性版本。CRISPRi系统可以针对转录起始位点(TSS)诱导异染色质转录沉默。

CRISPR/Cas9可用于标记(D)剪接位点，或(E)利用两个侧翼gRNAs删除INcRNA基因座的特定区域。

(F)能在TSS下游插入多腺嘌呤基化信号(3-5)，从而导致转录的过早终止。这些多聚(A)信号可以由氧氟沙星位置侧翼，以允许其去除。

(G)CRISPRa系统可针对转录起始点(TSS)诱导转录激活。

(H)可以将incRNA序列(CDNA)克隆到带有天然启动子或构成活性启动子的质粒中(E.(EF1a，CMV)。

根据每一列的副标题中描述的标准比较不同的工具。“靶”描述了INcRNA基因表达的哪些方面是靶向的，例如转录(CRISPRi，C)或转录后沉默(RNAi，A)。

“可逆转的功能损失？”这个工具在细胞中的沉默作用是可逆的吗？一般来说，只有核酸酶活性的Cas9活性(D)是不可逆的，因为基因座的区域实际上被删除了。

“表型类型”指的是该工具是否完全关闭了incRNA的表达。亚纯指的是，尽管有一定程度的压制，但仍有某种程度的表达。只有竞争移除该位点才能完全消除其表达。

击倒核子干扰RNA？涉及到许多群体所做的观察，这些观察表明RNAi在核中并不十分活跃(与其他技术不同)。“表型时间”是指从计划实验到获得表型的时间。

短：转染RNAi和ASO(A和B)仍然是最快速的表型途径，因为它们不需要克隆或修改细胞。

中等：CRISPRi/a(C，G)除了产生功能CRISPRi/a细胞系外，还需要设计和克隆特定位点的RNA。

中/长：CRISPR介导的缺失和加入多聚(A)信号(D和E)都需要筛选细胞(制造单细胞克隆)，以确定那些成功的修饰。

INcRNA研究思路

下面的流程图为研究lncRNA提供了一个指南。

• 不是全部数据库中的lncRNA都适用于开展研究。候选lncRNA的选择应考虑lncRNA的表达、种类和附近编码基因的变化。

• lncRNAs的生物信息表征可以使用多种在线数据库完成。

• 表达验证：包括表达验证和确认lncRNA实际上是非蛋白编码。

• 功能验证涉及lncRNA调控基因表达，以及揭示转录物中对其功能重要的特定顺式元件。

总结

lncRNA已经被深入研究了几十年。当时我们还不知道这些RNA代表了基因组中产生的最大的RNA基因家族。RNA测序提供了对人类基因组前所未有的洞察，从而发现了大量的非编码RNA转录物。

lncRNA的研究正以惊人的速度增长。通过查找已发布的RNA测序数据来选择lncRNA。此外，由于lncRNAs在表达模式上是细胞类型特异性的，单细胞测序技术的持续发展将不断优化和完善lncRNAs的数据库。