A Rab20-Dependent Membrane Traff

文献信息：`Schnettger, L., et al. (2017). "A Rab20-Dependent Membrane Trafficking Pathway Controls M. tuberculosis Replication by Regulating Phagosome Spaciousness and Integrity." Cell Host Microbe 21(5): 619-628 e615.

摘要：结核分枝杆菌（Mtb，Mycobacterium tuberculosis）驻留在吞噬体（phagosome）中，并且会打破该细胞器，进入细胞质中。而宿主细胞中维持这种吞噬体完整性的通路与机制还未研究。作者在此文献中研究了，包含Mtb的吞噬体的时间变化情况，确定了Rab32依赖的膜转运途径参与了Mtb在吞噬体中的维持。此途径能促进感染的巨噬细胞中内体膜的内流，它参与维持Mtb吞噬体的完整性，控制Mtb的复制。在那些严重结核病人体内，Rab20的表达上升。总之，作者发现了一个免疫调控的细胞途径，此途径能对抗Mtb的感染，维持那些含有Mtb的膜区室的完整性。

那些定植于内体膜区室中的胞内菌通常要么驻留在紧密吞噬体（tight phagosome）中，在这样的区室中，膜与细菌紧密结合，或者是胞内菌驻留在宽松吞噬体中（spacious phagosome），在这种宽松的吞噬体中，细菌与膜很少直接与内体膜接触。临床与基础研究证明说明，Mtb会驻留在紧密吞噬体和宽松吞噬体中。但是，现在还不完全清楚这两种形态上不同的吞噬体是如何产生的，它们在功能上是否有区别。Mtb会通过VII型分泌系统ESX-1（由region of difference 1，RD1编码）来打破吞噬体膜。此套系统可以使致病的肝菌进入细胞质。因此，Mtb可能位于不同的胞内区域，例如紧密吞噬体，宽松吞噬体，细胞膜，细胞质中。但是，调控这些胞内Mtb不同种群的宿主细胞机制还不清楚。

巨噬细胞分泌的IFN-gamma能激活内吞（endocytic），吞噬（phagocytic）和自噬（autophagic）途径，用于对抗病原体。IFN-gamma也能通过强化吞噬体的成熟来控制Mtb的复制。但最终Mtb还是能够进入细胞质，因此，虽然自噬是一种对抗病原体的重要途径，但是应该还存在着其它的IFN-gamma依赖的囊泡转运机制。

在这篇文献中，作者探讨了由IFN-γ刺激后的，Rab蛋白表达与胞内运输的途径。作者描述了在巨噬细胞中，Mtb吞噬体成熟的时空变化图谱，发现了IFN-γ刺激的，Rab20依赖的囊泡转运途径能够调节内体与Mtb吞噬体的相互作用。这种相互作用能够诱导吞噬体的损伤，导致Mtb驻留在宽松吞噬体中，并且限制Mtb的增殖。

FIG1A-使用RFP-Mtb（H37Rv）感染RAW264.7细胞，每隔32秒或4分钟，连续拍24小时。前15分钟进行定量。当巨噬细胞吞噬了Mtb后，前5分钟内，EGFP-Rab5与Mtb结合在一起，但经过这个时间点后，Rab5与Mtb就不在一起，Rab5位于早期吞噬体上，它参与RAB7A的招募，以及诱导这些早期内体到晚期内体。

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PI3激酶在调节许多细胞过程中起关键作用，包括细胞增殖、存活、运动和代谢等。活化的PI3激酶能使蛋白激酶B激活，进而通过一系列细胞信号通路诱导细胞癌变。当前，寻找PI3激酶的抑制剂已成为很多研究者的关注重点。研究表明，大多数肌醇头部基团PI(3)P同样需要第三类PI3激酶的活力才能维持，而PI(3)P又能特异性地与FYVE-finger(一种富含半胱氨酸的结构域)结合，因此可把FYVE结构域报告蛋白作为第三类PI3激酶的传感器进行研究。该方法使用的EGFP-2×FYVE融合蛋白由串联重复的FYVE-finger组成，这些FYVE-finger来自受肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（Hrs）的人类同源体。该方法可用于活细胞筛选分析，以定量测定当给予稳定转染了EGFP-2×FYVE融合蛋白的U-2 OS细胞需要测试的化合物时，EGFP-2xFYVE融合蛋白从早期内涵体中结合PI(3)P的最初位置转运至细胞质中的变化，进而判定该化合物对PI3激酶的抑制效果。

RILP全称是Rab-interacting lysosomal protein，它能与GTPase RBA7共同控制晚期内吞运输。PtdIns(3)P会临时升高。

Rab7与RILP与Mtb吞噬体结合，从6分钟开始，一直到60分钟持续结合。从这里可以看出，Mtb吞噬体先与Rab5结合，并且此时 PtdIns(3)P升高，从5分钟这个时间点开始，Mtb吞噬体离开Rab5，然后与Rab7结合，RILP结合。

文献报道，IFN-γ能诱导巨噬细胞中Rab20与早期吞噬体的结合。Rab20能诱导吞噬体成熟的早期延持，随着时间的增长，Rab5a与PI3P仍然与吞噬体结合。此外，敲除Rab20能消除IFN-γ诱导的吞噬体的成熟。Latex beads，乳胶颗粒。乳胶(latex)泛指聚合物微粒分散于水中形成的胶体乳液。又称胶乳。习惯上将橡胶微粒的水分散体称为胶乳，而将树脂微粒的水分散体称为乳液。有文献中指出，Rab20能在早期与乳胶颗粒结合，与Mtb结合一样（图片中可以看出，Rab20与Mtb结合持续到了24小时），能持续很久。

FIG1B-从图片上可以看出来，Rab20结合了Mtb后，囊泡会变大。从FIG1A中可以看出来，Rab7与Rab5则无此效应。这种膨大是因为Rab20阳性囊泡的融合导致的（有文献报道，IFN-γ能诱导Rab20囊泡的增大）。

FIG1CDE- Rab20能诱导包裹了Mtb吞噬体的膨大，并诱导它向宽松Rab20阳性水解吞噬体（proteolytic phagosome）的转运，这里使用了LAMP-2用于标记晚期内吞行为，并且用BMV109标记了蛋白水解行为（BMV109是一种用于标记活细胞的组织蛋白酶活性的探针）。FIG1C-在过表达了Rab20后的细胞中，感染了24小时后，吞噬体相对于细菌的面积。FIG1D-感染了Mtb 24小时后，与BMV109共同孵育。可以发现，Rab20内部蛋白水解酶的活动增强。FIG1E-BMV109和Rab20双阳性吞噬的比例，可以看出来，Rab20中几乎都存在着酶活性的增强。

FIG1F-过表达了Rab20后，明显可以发现细菌含量减少。

上述的结果就是为了说明，Rab20能够诱导膜向紧密吞噬体流入（紧密吞噬体是用Rab5和Rab7进行标记的），从而它能改变紧密吞噬体的结构，使紧密吞噬体向宽松吞噬体转换，然后这些宽松吞噬体与晚期则分到右区室融合（酶活性增强）。

Rab20是一个IFN-γ诱导的GAPase，因此，在未感染的巨噬细胞中过表达Rab20能模拟IFN-γ诱导的Rab20，作者研究了IFN-γ是否参与了宽松Mtb吞噬体的形成。

FIG2A-BMM与IFN-γ共孵育24小时。BMM用三种Mtb威不，分别为EGFP-Mtb，EGFP-MtbΔRD1（缺乏RD1的Mtb无法编码Mtb的VII型分泌系统ESX-1，ESX-1能诱导吞噬体膜的破坏），或EGFP-MtbΔRD1::RD1，然后用免疫荧光来染Rab20，用DAPI染细胞核。

FIG2B-分别对这三种细胞感染巨噬细胞后的Rab20进行定量。在静息状态下的巨噬细胞中（静息状态的巨噬细胞通常指的是未经IFN-γ等细胞因子刺激的巨噬细胞，经这些细胞因子刺激后，巨噬细胞会从静息状态转换为极化状态），15%的野生型Mtb与Rab20结合，有62%的EGFP-MtbΔRD1与Rab20结合。这说明了ESX-1有可能会将Rab20与Mtb吞噬体解离开来。

FIG2C-将野生型的Mtb与EGFP-MtbΔRD1共同感染巨噬细胞，Rab20与EGFP-MtbΔRD1的结合明显高于与野生型的Mtb结合。

上述的数据说明了，Mtb能够通过ESX-1系统对抗宿主细胞的Rab20包裹。

FIG4H-在WT RAW264.7中，用IFN-γ刺激后，Mtb受到抑制。而在Rab20敲除的巨噬细胞中，用IFN-γ刺激后，Mtb无变化。而突变株Mtb在Rab20 KO BMM中复制更多。在小鼠实验中，突变株也是如此。突变株的Mtb在Rab20KO小鼠的肺中病变区也更严重。

这一部分的体内与体外数据说明，WT Mtb能够有效地通过靶向作用于Rab20多聚吞噬体（phagolysosome）来发挥致病作用。而MtbΔRD1则能在持续地驻留在吞噬体中，并且被Rab20途径所限制，导致持续地被抑制。

FIG4I-结核病的RNA-seq数据也说明，Rab20是表达量最高的Rab GTPase。

Rab20阳性的宽松吞噬体多数也是LAMP-2阳性的。这说明宽松Mtb吞噬体具备晚期内吞的特征。附件中的数据还说明，IFN-γ能诱导宽松LAMP-2阳性Mtb吞噬体的形成。作者比较了WT BMM和Rab20 KO BMM中Mtb吞噬体的面积。

FIG3A-WT BMM与Rab20KO BMM感染EGFP-Mtb，24小进后，先与FM4-64X孵育，然后固定。

FIG3B-A中的定量结果，可以发现，加入了IFN-γ后，Rab20KO的BMM中的吞噬体面积无变化。

FIG3C-A中的定量结果，检测的是宽松吞噬体的数目。吞噬体的面积相对于Mtb的面积。

FIG3D-超分辨结果，感染了48小时后吞噬体的尺寸。

FIG3E-定量结果。

上述结果说明了，在WT的BMM中，IFN-γ能诱导包裹了Mtb吞噬体的面积增强。但是，当Rab20敲除后，这种效应就消失了。这说明了，Rab20不仅是一个宽松吞噬体的标记，并且还参与形成了宽松吞噬体。宽松吞噬体定义为面积大于2（我的理解就是，这个囊泡的面积是Mtb面积的2倍）。当用IFN-γ刺激后，在WT的BMM中，宽松吞噬体的数目明显升高。

因此这些数据说明，IFN-γ能强化Mtb向膨大的吞噬体的运输，并且这一过程需要Rab20的参与。附件中的数据也说明了，IFN-γ能诱导Mtb向LAMP-2阳性吞噬体的转运，这一过程也需要Rab20的参与。

FIG3F-IFN-γ能增强，LysoTracker阳性Mtb吞噬体的百分比，这一过程依赖于Rab20。LTR是LysoTracker-Red的缩写，巨噬细胞感染了Mtb后，与LTR共孵育。

FIG3G-使用了荧光淬灭型探针BMV109来监测蛋白质水解活性，然后观察到了，在与蛋白水解酶阳性区室结合的Mtb吞噬体中，水解酶的活性是以IFN-γ/Rab20依赖的形式进行增加的。

这一部分的数据说明，IFN-γ诱导的，Rab20依赖的宽松Mtb吞噬体的特征是这个样子的：酸性，有蛋白水解活性，与内吞细胞器相互作用。

在这一部分中，作者考虑到，ESX-1系统能导致吞噬体膜结构的破坏，以及干扰宿主细胞的自噬策略，因此作者研究了ESX-1依赖的这种逃避Rab20的策略是否与吞噬体膜的破坏有关。

半乳糖凝集素-8（galectin-8）是一种模式识别受体，参与识别细菌诱导的胞内感染，以及囊泡破坏。许多胞内菌会在细胞质的囊泡中复制，但是这些胞内菌会破坏囊泡，将细菌暴露于细胞质中。galectin-8与受损的囊泡结合会招募自噬受体，例如NDP52，进一步导致自噬小体（autophagosome）的形成，接着诱导宿主细胞清除细菌。Galectin-8敲除实验表明，在Galectin-8敲除的细胞中，胞内菌的增殖更强。

FIG4ABC-EGFP-Mtb感染Rab20KO和WT BMM，然后对galecitn-8，uniquitin，p62进行染色。 Rab20细胞中，Galecitn-8对Mtb的识别增强（Galectin-8变多了）。并且这种识别是ESX-1依赖的。

这说明，宿主膜结构被ESX-1破坏了，接着宿主吞噬体上的多糖暴露在细胞质中。作者还推断，分枝杆菌（mycobacteria）或分枝杆菌的某些成分是否也进入了细胞质中，这样它们就能被选择性自噬途径（例如uniquitin和p62）所识别。

FIG4B-在WT BMM中，p62与Mtb有共定位，而在Rab20KO的BMM中，这种共定位更强烈。

galectin-8，uniquitin和p62与Mtb的共定位并不依赖于IFN-γ，它有可能是由Mtb的膜破坏作用导致的。

FIG4D-使用超分辨观察，在感染的Rab20KO的BMM中，p62标记的，宿主来源的膜结构和囊泡结构与Mtb结合更紧密。

FIG4E-作者使用了LysoTracker探针来观察吞噬体的完整性，BMM与LTR先共孵育1小时，然后感染Mtb。在WT BMM感染的不同阶段，Mtb吞噬体会变弱，它与内体融合后，在新的吞噬体中，又会恢复LTR的强度。LTR变弱是说明了，吞噬体膜被破坏了，LTR

附件中的数据指出，EGFP-MtbΔRD1吞噬体多数是LTR阳性的，并不弱。

FIG4G-EGFP-Mtb与LTR结合的百分比（感染了24小时），在Rab20KO的BMM中，感染了24小时后，弱的吞噬体并不会维持，

总之，在Rab20缺陷的巨噬细胞中，它的吞噬体膜的完整性能够更好地维持。