文献精读丨GWAS+TRN多组学方法揭示小麦穗发育调控过程

作者: 生信分析笔记 | 来源:发表于2022-12-09 10:45 被阅读0次

文献精读笔记

英文题目：Systematic mining and genetic characteriza；tion of regulatory factors for wheat spike development

中文题目：小麦穗发育调控因子的系统挖掘及遗传特性研究

通讯作者：Jun Xiao，Chinese Academy of Sciences，Beijing, China

发布时间：2022.11.11 bioRxiv

doi：10.1101/2022.11.11.516122

论文初步介绍

研究目的

小麦每穗粒数是决定单产的重要性状，增加每穗小穗数能够增加每穗粒数并最终增加产量，提高花序分生组织的活性和创制多小穗的种质是提高小麦小穗数的有效途径，提高穗粒数是高产、超高产小麦栽培和品种选育的主攻目标。

该文章从转录组学、表观遗传学、基因组学等多组学手段，深入解析了小麦穗发育过程中转录因子的调控网络和层次关系。

摘要

① 本文将多组学数据，系统地探讨了小麦穗发育的遗传调控网络。产生了8个发育时期的转录组和表观基因组图谱。

② 作者发现染色质可及性和H3K27Me3组蛋白的变化与开花过程中转录组改变密切相关。

③ 构建了一个核心转录调控网络(TRN)，该网络可能驱动各种分生组织细胞转换形成穗。

④ 将TRN与全基因组关联分析(GWAS)相结合，共鉴定出260个转录因子，其中52个是作物特有的转录因子，但大部分未被研究。

⑤ 进一步验证了TRN提出的TASPL6、TsMADS34和TAMADS14之间的多层调控模块。TaMYB4-A可能通过调节激素稳态或信号传导从而调节可育小穗数，作用于下游并受WFZP抑制。

⑥ 在国内育种过程中，逐渐筛选出TaMYB4-A的优势等位基因，表达量高，小穗可育性强。本文为系统地理解小麦穗发育的遗传调控提供了宝贵的资源和新的策略。

创新点

制作了转录组和表观基因组图谱
构建了核心转录调控网络
验证了穗发育过程的多重调控模块

注释缩写信息补充

技术介绍

ATAC-seq:Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing，利用转座酶研究染色质可及性的高通量测序技术，属于表观遗传学研究领域。

真核生物的基因组DNA是被高度紧密折叠包装的，DNA与组蛋白缠绕形成核小体，串珠状的核小体经过螺旋折叠等方式盘绕成染色体。DNA需要进行转录等活动的时候，DNA的高级结构才会部分解开，裸露出需要与转录因子等反式作用元件进行作用的DNA双链（未经组蛋白或核小体保护的DNA部位），便于转录。染色质的这种特性叫做染色质的可及性（chromatin accessibility），而暴露的这段染色质称为“开放染色质”（open chromatin），研究发现，开放染色质通常是转录因子、增强子、绝缘子或者其他调控蛋白结合的片段，结合的过程仿佛是触发了细胞内的开关，可以影响细胞内基因复制以及调控基因的转录活性。转座酶可以将携带的DNA片段（接头）插入开放的染色质区域，可以得到全基因组上处于开放状态的染色质区域。

RNA-seq：转录组测序技术，就是用高通量测序技术进行测序分析，反映出mRNA,smallRNA,noncodingRNA等或者其中一些的表达水平。
H3K27me3：表观遗传修饰，H3是组蛋白，H3K27me3表示组蛋白H3的第27个氨基酸上三甲基化，这是一个标记，表明赖氨酸27三甲基化的组蛋白。
TRN：转录调控网络(transcriptional regulation network)是由转录因子(transcription factors,TF)和其目标基因的调控关系所构成的有向网络
WFZP：一个控制小麦穗形态的基因。New Phytologist发表了倪中福教授团队题为FRIZZY PANICLE defines a regulatory hub for simultaneously controlling spikelet formation and awn elongation in bread wheat的论文，其中讲到WFZP抑制小穗形成但促进芒伸长相关内容。
TSS：转录起始位点
DAPR：differential accessible promoter regions ，差异可及启动子区
Motif：模体，基序。一段典型的序列或者一个结构。

是指构成任何一种特征序列的基本结构。通俗来讲，即是有特征的短序列，拥有生物学功能的保守序列，可能包含特异性的结合位点，或者是涉及某一个特定生物学过程的有共性的序列区段。基于motif序列的提取，我们可以预测潜在的结合位点。比如转录因子的结合位点，其motif往往意味着某蛋白结构域与DNA碱基序列的相互作用

TILLING：即Targeting Induced Local Lesions IN Genomes（定向诱导基因组局部突变技术）
Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag)：目标下的切割和干扰(Cut&Tag)

小麦穗部性状

GNPS：grain number per spike，每穗粒数
SNS：spikelet number per spike ，每穗小穗数
FSPS：fertile spikelet number per spike，每穗可育的小穗数
DSNS：degenerated spikelet number per spike ，每穗退化的小穗数
FNPS：floret number per spikelet ，每小穗的小花数
SD：spikelet density，小穗密度
SL：spike length ，穗长
IM：inflorescence meristem，花序分生组织
SM：spikelet meristem，小穗分生组织

小麦穗发育阶段

SAM：shoot apex meristem，顶端分生组织
EL：elongation stage，伸长期（生长锥伸长期）

茎生长锥伸长生长，长度大于宽度，呈透明光滑的圆锥形。
SR：single edge ，单棱期（穗轴节片原基分化期）

生长锥迅速伸长，生长锥的基部由下而上形成像叶原基的环状突起，即为苞叶原始体。每片苞叶原始体之间即为穗轴节片。每个苞叶原基呈棱形，故称单棱期。
DR：double ridge，二棱期

小穗原基分化期,苞叶原基发育逐渐停止，在幼穗中部两个相邻苞叶原基之间最先长出一个突出，即小穗原始体，呈棱形，开始较小，以后逐渐增大，在生长锥上成长大、小棱相间存在故称二棱期。
SMI：spikelet meristem initiation stage，小穗分生组织起始期
GPD：glume primordium differentiation stage ，护颖原基分化期

幼穗中部两侧小穗原基已分化结束，顶端小穗原基逐渐分化，此时每穗小穗数基本定型,中部小穗基部形成两个碗状突起，后发育成颖片。
FMI：floral meristem initiation stage，小花分生组织起始期
FOP：floral organ primordia differentiation stage 小花原基分化阶段

小花原基分化先从幼穗中部，然后向上向下相继分化。

研究结果

转录组和染色质图谱

展示了穗发育的8个时期，利用转录组测序RNA-seq和染色质可及性测序ATAC-seq得出了全局基因表达、染色质可及性信息。同时，基于染色质开放动态，选择SAM、DR、SMI、GPD和FOP五个阶段，在靶点和靶点作用下进行组蛋白修饰分析

主成分分析(PCA)结果表明，这8个阶段可分为两大类，营养生长组包括SAM、EL、SR、DR和生殖生长组包括SMI、GPD、FMI和FOP

在DR到SMI、FMI到FOP等形态学转变点，相邻阶段间差异表达基因较多

通过聚类方法鉴定阶段特异性表达基因，从具体聚类中突出了参与开花时间和花序发育的已知调控因子。例如，Cluster 2中的开花时间基因TappD1在花从SAM向DR过渡之前表达。表明可以捕捉到小麦穗发育过程中的动态基因表达谱。

可及染色质主要位于远端基因间区和启动子区

PCA分析揭示小麦穗发育过程中染色质可及性动态的变化轨迹

从营养生长到开花过渡和花序萌发过程中，染色质的可及性总体呈上升趋势，而在小穗和小花形成过程中，染色质的可及性呈下降趋势。

主成分分析和聚类分析表明，在不同发育阶段，不同组蛋白修饰具有阶段特异性的转变。

值得注意的是，H3K27Me3呈现连续轨迹，而其他的则不是，可能具有较高的相关性。

H3K27Me3和染色质可及性共同影响穗发育过程中不同基因的表达模式

染色质环境对调控的影响

共鉴定出49,153个DAPR（差异可及启动子区），分为6个cluster。其中，大多数在DR期或SMI期表现出更高的可及性。
图B中2,3,4,6这四个基因簇的染色质可及性与转录表达能力呈较高的正相关。
通过分析发现，表达量增加的基因显著重叠，染色质可及性增加的程度与表达水平升高的变化高度相关。

对基因集I中的基因进行GO富集分析，发现激素合成和信号传递、花序分生组织发育、细胞分裂不对称性相关基因富集程度较高。
热图结果表明在营养顶端分生组织向花序分生组织过渡过程中，染色质可及性的增加与基因表达的提高是同步的
基因集II虽然在SMI和GPD阶段染色质可及性提高，但相对开放程度较低。结果表明，随着H3K27Me3基因表达水平的降低，如WAP3基因表达水平逐渐升高，这可能是H3K27Me3启动转录状态的原因之一。对于基因集III，可以发现其染色质可及性最低和H3K27ME3组蛋白修饰覆盖度最高，限制了基因的激活，就像TAEHD2基因一样。

基因共表达和转录调控网络

随着生殖生长（DR）的开始，依次经历SMI、GPD、FMI和FOP过程形成穗结构，这是决定SNS每穗小穗数的关键，有助于粮食产量。因此，作者分析了基因共表达情况和调控网络，目的是找出控制这一过程的潜在因素。

作者基于PCA的距离计算了SMI到FOP阶段的伪时间，发现GPD期和FMI期（前半段）相对比较接近
在穗结构形成过程中，在四个阶段里一共鉴定出了8200个基因差异表达DGE，分为6个不同的簇cluster。
- 花分生组织和各种激素代谢基因在SMI中高表达；
- 激素信号转导、极性建立相关基因在GPD和FMI中高表达；
- 在花器官发育方面，极性控制基因在FOP时高表达。
  1. 同时，发现在第3簇和第6簇内，ERF和WRKY转录因子TFS在SMI期富集并高表达。
  2. 这种基因表达模式符合时空特征，并说明了单个TFs家族在调控穗发育过程转录网络中的潜在重要性。

可及性较高的染色质区域能为TF的结合提供对接位点，在图中，可以看出ERF、BHLH和SPL的结合基序（模体）在SMI与FOP的结合过程中可及性变异程度最大，说明这些TFs转录因子具有的潜在重要性。
从SMI到FMI的时间序列表达基因簇之间存在明显的序列调控关系，即C6-C3-C2-C4。而在C1和C5中，FOP特异表达的基因是相互分离调控的。表明小穗和小花发育之间存在不同的转录调控网络
从图中可以看出ERF、B3、TCP等TFs可能在该网络中起核心调控作用

在该调控网络中可以找到一些与小麦穗发育有关的调节因子，比如：TaTB1、VRN1。表明了作者构建出来的TRN网络在发掘重要调节因子方面的能力。
接下来，作者为了验证TFs之间转录调控层次的预测能力，提取了一个小模块，其中包含了在其他作物中单独进行功能研究但尚未知道调控关系的因子，比如SPL6、MADS34。即红框中这些因子
作者推测在SPL6-MADS34-MADS15-HMA模块后有一个正的转录调控体系，通过荧光素酶报告检测，在烟草叶片中观察到它们之间存在一个正转录调控回路。

多组学数据挖掘调控因子

染色质的开放区域是建立转录调控关系的关键

多数TFs结合基序存在于染色质的开放区域。
在转录因子结合中心区域，DNA的变异程度明显降低。
在开放染色质区域含有明显较高的GWAS信号，这些信号与穗形态特征相关。
开放染色质区的QTL频率是全基因组QTL频率的5倍，GNPS、SNS等许多性状均有类似结果。

作者以每穗可育小穗数FSPS为例，经GWAS分析，共有153个显著相关位点，将候选区间扩大到以GWAS信号峰为中心的1兆比MB,共鉴定出2916个候选基因。其中有1762个基因(C1和C4)在DR和SMI阶段的染色质可及性开放程度最高，这可能与小穗原基的分化有关，最终影响小穗数。这一结果表明，大部分GWAS候选基因在与相应性状关键发育阶段具有较高的染色质开放度。
一共6000多个基因，以转录因子TFS编码基因为要求，得到776个候选基因进行进一步筛选，其中，超过一半（404个TFs）位于穗发育相关的遗传区域内。然后通过寻找开放染色质区域中的SNP来进一步将候选TFs缩小到260个，它们可能影响转录调控回路，并重新连接穗发育的转录调控网络TRN

在候选TFs中，分为三类:第一类在小麦中功能已经被研究，第二类在其他物种中已被研究，称其为“保守型”，第三类在小麦和其他作物中功能未知，称其为“新型”
值得注意的是，大多数是“新型”转录因子TFs，多达208个，它们没有在小麦或其他作物中研究过。这些转录因子TFs在ERF、WRKY、BHLH、MYB、B3家族中富集。

验证调控因子遗传结构

在保守型调控因子中，TaSPL6, TaMADS34, TaMADS15同样出现在之前提到的转录调控网络中，因此，作者接来来验证它们是否会参与穗发育过程。

通过原位杂交技术展示了这些调控因子时空表达模式，TaSPL6，TaMADS34和 TaMADS15在SAM期弱表达，而在SMI和FOP期高表达。TaHMA是TaMADS15的下游靶位点，在FOP小花原基中也有表达。相似的时空表达模式说明它们在穗发育中的转录调控结构和潜在作用。
然后作者对这三个调控因子进行RNAi沉默，得到转基因植株，34和15（后两个）表现出相似的表型变化，穗长SL缩短
每穗小穗数SNS降低
穗粒数GNPS降低

在TasPL6-RNAi转基因小麦中，观察到TaMADS34的表达显著降低，进一步表明TaSPL6正向调节TaMADS34，另外后续的调控过程也相类似。证明TASPL6-TAMADS34-TAMADS15-TAHMA模块在小麦穗发育过程中具有调控功能。
然后从进化的角度进一步分析了小麦和禾本科中TASPL6-TAMADS34-TAMADS15-TAHMA调控模块，在二倍体、四倍体、六倍体小麦中，发现在MADS15同源基因的启动子区均存在一个MADS34结合模体，同时，在附图5C中，可以得出在MADS34同源基因的启动子区存在SPL6的结合模体，表明该调控模块可能在小麦中保守。
然而，在水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea Mays）中，MADS15的启动子区没有MADS34的结合模体，MADS34的启动子区也没有SPL6的结合模体，说明该调控模块在禾本科植物中可能存在差异。

验证新发现的调控因子

作者为了验证该模型在识别新型小麦穗发育调节因子方面的能力，研究了Kronos、Cadenza、KN9204的Meta Tilling突变系的穗发育缺陷，将其突变位点经全外显子测序鉴定。

全外显子测序：利用序列捕获技术将全基因组中所有外显子区域DNA序列捕获，富集后进行高通量测序的方法。可用于研究已知基因的单核苷酸多态性位点、插入缺失位点等，不适合用于研究基因组结构的变异。

在208个新型TFs中，131个TFs包含至少有一个功能缺失突变的突变系
在85个纯合突变株系中，有44个TFs在三种类型中表现出穗发育缺陷,分别是：
1. 第一组：开花时间差异
2. 第二组：小穗或小花退化差异
3. 第三组：穗长或每穗小穗数差异
图C和D展示了不同类型的突变系，可以得出：
1. TaCAMTA-A突变体的开花时间比对照提前了两周左右
2. TaWRKY37-A突变体的退化小穗数显著增多，导致穗粒数降低
3. TabHLH009-A突变体突变体穗长缩短，小穗密度增加

在四倍体小麦Kronos的功能缺失突变体TaNAC22-A中，由于花原基分化没有正常终止，所以每个小穗的小花数增加。但是多数小花败育，最终导致穗粒数GNPS降低。
通过原位杂交进一步证实了这些基因的时空表达模式，TaWRKY37-A、TabHLH009-A和TanAC22-A基因均在小穗发育起始期和花原基分化期，与它们的表型缺陷一致。
- TaWRKY37-A在穗基部和小花分生组织中高表达
- TaBHLH009-A在穗上部和小花分生组织中高表达
- TaNAC22-A在小花原基中有显著表达。

TaMYB4-A对穗发育的影响

为了进一步了解TRN和GWAS技术在单个基因分子功能研究中的应用前景，作者选取了一个新型调控因子TaMYB4-A进行深入的研究。TaMYB4-A是TRN中的TFs之一（在前期调控阶段）

通过GWAS分析，发现它位于一个与每穗可育小穗数FSPS显著相关的区间内。
它的两种单倍型（C型和T型）可分离出214个小麦自然群体，它们的每穗可育小穗数FSPS具有差异显著。
通过原位杂交发现TaMYB4-A在DR期的小穗分生组织初步表达，在SMI期和FMI期的小穗和小花原基中高表达，说明它在确定小穗数中起作用。

作者从KN9204、Cadenza中找到了TaMYB4-A功能缺失突变体，发现突变后SL、SNS、GNPS显著降低，进一步证实了它在调节小穗发育中的作用。
荧光素酶报告检测得出在TaMYB4-A的潜在上游调节因子中，WFZP和DOF型TF TADOF17(Traescs2B02G592700)分别能抑制或激活烟草中的TaMYB4-A。
1. TaAP2-39：通过控制ABA/GA平衡调控水稻分蘖和穗/花序的发育
2. TaI-BAK1：与油菜素甾体激酶相关，在水稻中过量表达可增加穗长和每穗粒数
3. TaPILS7：编码生长素载体成分
上面三个基因在穗形成过程中表现出与TaMYB4-A同步的时空表达模式

WFZP高表达转基因小麦中TaMYB4-A的表达量下调，进一步证明了WFZP对TaMYB4-A的抑制作用
小麦TaMYB4-A的遗传网络

TaMYB4-A关键SNP变异影响

最后，作者想知道TaMYB4-A的不同单倍型是如何影响小麦穗部结构，因此进行关联分析

SNP-939(C/T)变异位点位于TaMYB4-A的启动子区，而且刚好在WFZP核心结合基序的下方。该位置的SNP变异可能通过影响WFZP结合从而导致TaMYB4-A表达差异。
通过对保守基序的识别，证实了WFZP对TamyB4-A的抑制作用，在荧光素酶报告试验中，发现烟草叶片的C→T突变消除了这种抑制作用
作者进一步选择了两种类型（C型和T型）的33个不同小麦品种，测定了TaMYB4-A的表达量和穗形态
- C型：表现出优良的农艺性状，即SL较长，FSPS较多，TaMYB4-A表达水平显著较高
- T型：表现出SL较短，FSPS较少，TaMYB4-A表达水平较低。
这一结果为SNP变异引起TaMYB4-A表达水平差异进而影响SL和FSPS提供了遗传学依据

此外，作者还想知道TaMYB4-A启动子中的C/T变异位点是如何在我国育种过程中被选择的。于是基于中国小麦微型核心种质的外显子捕获测序数据，得出：

相比于引进品种（45.45%），我国地方品种（82.08%）和现代品种（78.18%）携带C型等位基因的种质比例较高。
随着育种时间推移，C型的等位基因频率显著升高，表明TaMYB4-A的C型基因在我国育种过程中得到了广泛的应用，尤其是1978年以后。
自1950年以来，骨干亲本在我国广泛应用于小麦品种改良，包括Zhoumai16, St2422/464, Nanda2419,Nanda2419, St2422/464, Funo, Xiaoyan6, Aimengniu, Zhou8425B, Abbondanza and Lovrin10（图中的十个品种），21个骨干亲本中有17个在SNP-939位点为C型，除了Aimengniu 和 Lovrin10，这两个亲本的衍生品种在我国广泛种植，这些衍生品种更倾向于从另一个亲本中保留SNP-939的C型。
该图是SNP-939在中国不同生态区的等位基因的比例，中国主要小麦种植区的等位基因具有明显的分布特征，以下为T型的占比情况：
- 春小麦区相对较多(≥40%，VI, VII, VIII）
- 其次是冬春混合区（IX和X，分别为22.22%和23.08%）
- 在冬麦区(I、II、III、IV、V)出现频率较低(<20%)
  
  因此，TaMYB4-A的C型等位基因可能来源于中国地方种质，在育种过程中被广泛应用

讨论部分

小麦是最早被驯化的作物之一，驯化与穗部结构变化联系在一起，以利于收获和提高产量。提高产量也是育种的主要目标之一。对于谷类作物来说，穗结构通过影响小穗和小花的发育，在很大程度上决定着籽粒数量,研究控制穗部结构的分子机制将有助于设计育种过程.

作者制作了一个基于时间序列的表观基因组图谱，包括从营养发育到生殖生长过程中各种类型的组蛋白修饰，染色质可及性变化和转录组数据，这将为系统研究小麦穗发育的关键调控因子提供有价值的数据资源。

总之，作者结合多组学数据揭示了小麦穗发育过程中的转录调控网络TRN和表观遗传变化。结合GWAS分析，作者发现了几十个影响小穗结构的新调控因子，揭示了TaMYB4-A启动子内WFZP结合位点的SNP变异在我国小麦育种过程中起着关键作用。

材料与方法

材料：冬小麦品种KN9204

环境：温室

取样：在8个发育阶段，各取10-50个小穗

转基因植株

利用冬小麦品种KN9204进行基因序列扩增，春小麦品种Fielder获得转基因小麦植株

测序数据处理

reference genome：Chinese Spring-RefSeq v1.0
FastQC v0.11.8：for ensure the high quality of reads
BWA-MEM v0.7.17：for ATAC-seq and CUT&Tag seq
hisat2：短序列比对工具，主要用于RNAseq数据的比对
Samtools v1.4：进行索引、排序、过滤
Picard v2.23.3：删除读数中重复项
deepTools v3.3.0：数据规范化可视化

RNA数据分析

Counts v2.0.1：计数
DESeq2 v1.26.0：差异表达分析
ComplexHeatmap (v2.4.3)：聚类、可视化
clusterProfiler v3.18.1：基因功能富集

ATAC-seq数据分析

MACS2 v2.1.4：调用峰
ChIPseeker v1.26.2：注释峰
HINT tool v0.13.2：鉴定转录因子变化情况

差异染色质修饰富集区检测

DiffBind v2.16.2：计算峰值读数

构建基因调控网络

通过PCA分析对穗发育过程中表达的基因进行分组
计算相邻组之间的欧几里得距离
进行坐标缩放，计算基因的拟合曲线
根据基因表达情况和标准化的数据，对每个基因进行PCA分析

构建系统发育树

利用水稻MADS34和MADS15蛋白序列鉴定小麦和玉米中的同源基因
MUSCLE v3.8.1551：序列比对
trimAl v1.4.rev15：筛选氨基酸位置
RAxML v8.2.12：构建最大似然系统发生树

GWAS全基因组关联分析

214份小麦660K单核苷酸序列中筛选出319,558个单核苷酸序列与表型进行关联分析
Tassel v5.2
CMplot：Manhattan plots and quantile-quantile plots

基于基因的关联分析

利用287份中国小麦微型核心种质的全基因组外显子捕获测序数据，确定了TaMYB4-A基因6kb区的单核苷酸多态性，包括外显子区、内含子区、4kb启动子区和0.5kb 3'-UTR区。

Haploview 4.2：计算连锁不平衡，制作LD图

数据获取

Genome Sequence Archive：https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa
PRJCA013096

荧光素酶实验

LUC荧光素酶，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

荧光素酶基因报告是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光，是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

原位杂交

原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。

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