本文选自nature，2015年，doi:10.1038/nature14344，喜欢的可以自行下载阅读。
摘要：虽然p53介导的细胞周期停滞、衰老和凋亡是癌症发展的关键障碍，但新的证据表明p53的代谢活性也很重要。在这里，我们表明p53通过抑制胱氨酸/谷氨酸反转运体的关键成分SLC7A11的表达，抑制胱氨酸摄取并使细胞对铁死亡敏感。值得注意的是，p53 3KR是一种乙酰化缺陷型突变体，不能诱导细胞周期停滞、衰老和凋亡，完全保留了调节SLC7a11表达和诱导活性氧(ROS)诱导的应激引起的铁死亡的能力。对突变小鼠的分析表明，这些非典型p53活性有助于胚胎发育和与Mdm2丢失相关的致死性。此外，SLC7A11在人类肿瘤中高度表达，其过表达抑制ROS诱导的铁死亡，并在异种移植模型中消除p53 3KR介导的肿瘤生长抑制。我们的发现揭示了一种新的肿瘤抑制模式，该模式基于p53对胱氨酸代谢、活性氧反应和铁死亡的调节。
p53肿瘤抑制途径的失活是大多数人类癌症形成的关键事件。传统上，p53的肿瘤抑制活性被认为反映了其响应细胞应激而引发细胞周期停滞、凋亡和/或衰老的能力。然而，最近的研究表明，p53的其他非常规活性对其肿瘤抑制功能也至关重要。p53蛋白通过作为选择性调节某些p53转录靶基因表达的脱氧核糖核酸结合转录因子来实现其多样的细胞结果。应激诱导的p53蛋白活化主要是通过翻译后修饰实现的，我们最近对表达乙酰化缺陷型p53突变体的小鼠的研究表明，乙酰化差异调节p53介导的细胞周期停滞、凋亡和衰老。值得注意的是，突变型p53 3KR多肽虽然在引发细胞周期停滞、凋亡和/或衰老的功能上有缺陷，但仍保留其肿瘤抑制功能和调节代谢靶点表达的能力，这表明p53介导的代谢调节与抑制体内肿瘤形成密切相关。
鉴定P53的靶点是SLC7A11
为了阐明p53介导的代谢调节的确切作用，我们试图通过产生四环素控制(tet-on) p53诱导细胞系用于微阵列分析来鉴定新的p53靶基因。用Partek软件检查阵列数据，鉴定诱导和非诱导细胞之间差异表达的基因(扩展数据表1)。编码胱氨酸/谷氨酸反转运体的一个组分的SLC7A11被鉴定为新的p53靶基因。虽然四环素处理对亲代H1299细胞中SLC7A11表达没有明显影响，但是在tet-on p53诱导型细胞系中观察到SLC 7a 11 mRNA表达的进行性抑制(扩展数据图1a)，并且蛋白质印迹分析显示p53激活严重降低SLC 7a11蛋白水平
人SLC7A11基因的5’侧翼区位于染色体4q28-31。包含一个与共识的p53结合序列匹配的位点(图1B)，
当高纯度的重组全长人野生型p53与包含该位点的放射性标记寡核苷酸探针孵育时，通过电泳迁移率改变分析(EMSA)很容易鉴定出p53-DNA复合物(图1C)。
此外，这种p53-DNA复合体在p53特异性抗体存在的情况下发生了超移位，并通过与未标记探针的竞争而显著减弱。此外，对人骨肉瘤U2OS细胞(表达野生型p53)的染色质免疫沉淀(ChIP)分析表明，内源性p53多肽占据了SLC7A11基因的启动子区域(图1D)。
此外，当p53被Nutlin-3处理激活或DNA损伤时，SLC7A11的蛋白水平显著降低(图1E和扩展数据图1B)。
相反，在p53下调的条件下，SLC7A11的下调被完全取消(图1E)。在其他表达野生型p53的人类癌细胞株(H460和MCF-7)中也观察到了类似的结果，而在p53缺失的细胞(H1299和SAOS-2)中没有检测到明显的作用(扩展数据图1C-e)。综上所述，这些数据表明SLC7A11基因是p53介导的转录抑制的靶点。
P53 3KR对SLC7A11表达的调节
我们先前的研究表明，p53 3KR能够激活TIGAR和MDM2的表达，但不能激活p21(也称为CDKN1A)或PUMA(也称为BBC3)的表达。值得注意的是，在p53 3KR诱导后的不同时间点，SLC7A11水平急剧下降(图2A)。
染色质免疫沉淀(ChIP)分析表明，p533KR蛋白能够与SLC7A11基因的启动子结合(图2B)。
为了在更多的生理环境下证实这一发现，我们检测了来自p53+/+、p533KR/3KR和p53-/-小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中SLC7A11转录本的水平。定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)分析表明，与野生型MEF相比，SLC7A11的表达显著增加倍(图2C和扩展数据图1F)。
然而，在p53 3KR/3KR细胞中，SLC7A11的转录水平仍然很低，这表明p53 3KR可以通过类似野生型p53的方式抑制SLC7A11的表达。此外，芯片分析显示，小鼠p53被招募到小鼠Slc7a11启动子区域，而与野生型和p53 3KRMEF中的Re3位点相对应的引物被招募到小鼠SLc7a11启动子区域，但在p53缺失的MEF中没有(扩展数据图1g，h)。
这些数据表明，乙酰化缺陷突变体p533KR在体内仍具有调节SLC7A11表达的能力。
胱氨酸摄取与铁死亡的调节
SLC7A11是质膜转运蛋白XCT的重要组成部分，介导细胞摄取胞外胱氨酸以换取胞内谷氨酸。为了了解p53介导的抑制SLC7A11表达的功能后果，我们首先研究了p53激活对细胞摄取L-[14C]-胱氨酸的影响。的确，四环素处理后，tet-on p53 3KR诱导细胞的胱氨酸摄取水平降低(图2D)。为了在更具生理性的环境中研究这种影响，我们还检测了p53-/-、p53 3KR/3KR 和p53+/+MEFs。如图2E所示，p53-/-MEFs的胱氨酸摄取增加到比p53+/+ MEFs高约60%的水平，证实p53的缺失促进了细胞对胱氨酸的摄取。然而，我们没有检测到p53 3KR/3KR MEF细胞对胱氨酸摄取的增加，这表明p533KR在体内仍然具有抑制胱氨酸摄取的能力。
值得注意的是，最近的研究表明SLC7A11的表达对铁死亡也是至关重要的，铁死亡是一种铁依赖的非凋亡性细胞死亡，涉及代谢功能障碍。为此，我们通过使用铁死亡诱导剂erastin治疗早期传代的MEF，研究了p53是否影响细胞对铁死亡的敏感性。尽管erastin诱导了p53+/+和p53 3KR/3KR MEF的高水平细胞死亡(>48%)，但在p53阴性细胞中只观察到低水平的细胞死亡(20%)(图3A和扩展数据图2A)。
此外，通过动力学分析，早在处理后6h，p53+/+和p53 3KR/3KR MEFs就很容易检测到细胞死亡(图3B)。虽然在p53缺失的细胞中也检测到一小部分细胞死亡，但在不同浓度的erastin暴露的不同时间点，对p53缺失的细胞Versus531/1或p533KR/3KRMEFs的不同影响非常明显(图3B和扩展数据图2B)。
用透射电子显微镜观察经Erastin处理的细胞，我们观察到线粒体变小，膜密度增加，但没有明显的DNA片段化(图3C)，
这是TNF处理后凋亡细胞的一个特征形态学特征(扩展数据图2C)。
Western blot分析表明，Eastin诱导的细胞死亡也不能诱导PARP1裂解和caspase3激活，TUNEL法证实铁死亡缺乏DNA片段化(扩展数据图2D-f)。
为了确认ERASTIN诱导细胞死亡的方式，我们用铁蛋白15的特异性抑制剂--铁抑素-1(FERR-1)处理细胞。值得注意的是，FERR-1完全挽救了p531/1和p533KR/3KRMEF中的细胞死亡(图3D)。相反，其他形式的细胞死亡抑制剂，包括自噬(3-甲基腺胺)、凋亡(Z-VAD-FMK)和坏死抑制素(Necrostatin-1)，尽管它们在相同的MEF中分别能够抑制自噬、坏死下垂和凋亡，但它们未能抑制Erastin诱导的细胞死亡(图3D和扩展数据图2G)。此外，几种额外的铁死亡抑制剂也被证明能有效地阻断p53介导的p53 3KR/3KR MEFs的铁死亡(扩展数据图3F)。综上所述，这些数据表明p53 3KR保留了调节细胞摄取胱氨酸和促进铁死亡的能力。
SLC7A11在铁死亡和肿瘤抑制中的作用
以前的研究表明，SLC7A11在几种形式的人类癌症中都有过表达。在分析了20对人类肿瘤与邻近正常组织的对比后，我们观察到大约70%的人类癌症样本(8/10的结肠癌样本，3/5的肝癌样本和3/5的肾癌样本)都有SLC7A11的过表达(扩展数据图4A-C)。
为了进一步评估其在肿瘤发生中的作用，我们利用共聚焦显微镜在这些组织切片上进行了SLC7A11的免疫荧光染色分析。如图4A所示，膜标记(ATP1A1)(绿色)和SLC7A11(红色)主要定位在质膜上。
更重要的是，虽然ATP1A1(绿色)在正常组织和癌组织中的水平相似，但SLC7A11(红色)在恶性肿瘤细胞中的水平明显高于邻近的正常细胞。虽然SLC7A11在所有p53突变的肿瘤中都升高，但SLC7A11上调也发生在表达野生型p53的肿瘤中(扩展数据图4e)，这表明其他因素也可能影响人类癌症中SLC7A11的表达。
为了探讨p53介导的SLC7A11和铁死亡在人癌细胞中的作用，我们首先检测了erastin对p53 3KR诱导的H1299细胞端粒酶活性的影响。正如预期的那样，在没有p53 3KR诱导的情况下，这些细胞对erastin介导的铁死亡具有很强的抵抗力(图4B和扩展数据图5A)；
相反，在四环素诱导存在erastin 的p53 3KR时，观察到高水平的细胞死亡(>80%)。同样，在FERR-1存在下，p533KR诱导的铁下垂活性被抑制(扩展数据图5B)。
值得注意的是，SLC7A11的过表达将这些细胞从p53 3KR依赖的铁下垂中拯救出来(图4B)，并取消了p53 3KR介导的克隆形成减少(扩展数据图5C-e)。这些数据表明SLC7A11在人类肿瘤样本中过表达，异位表达的SLC7A11可以抑制p533KR诱导的人癌细胞铁死亡。
为了验证p53介导的SLC7A11表达在独立于细胞生长停滞、凋亡和衰老调节肿瘤抑制活性中的作用，我们检测了SLC7A11过表达是否影响p53 3KR 异种移植瘤模型诱导的肿瘤生长抑制。在异种移植瘤生长实验中，四环素诱导p533KR表达后(图4C)，p53缺失的H1299细胞的生长显著减少(图4D，图III与图I)；然而，在SLC7A11过表达的情况下，p533KR的抑瘤作用在很大程度上被取消(图4D，图IV与图4E)。这些结果表明SLC7A11的表达在p533KR诱导的肿瘤生长抑制活性中起着至关重要的作用。
P53在胚胎发育中的代谢调控
多项研究表明，p53在细胞凋亡、细胞生长停滞和衰老中的典型活性是p53+/+ Mdm2-/-小鼠胚胎致死性的主要原因，这些胚胎在发育E3.5-E5.5天死亡。为了评估p53的非典型活性是否与这一表型有关，我们对p53 3KR/3KR 及Mdm2-/+小鼠进行了杂交，并对其后代进行了基因分型。鉴于p53 3KR突变体未能诱导p53介导的细胞周期阻滞、凋亡或衰老，我们惊讶地发现，在这些杂交的后代中完全没有p53 3KR/3KR Mdm2-/-pups(扩展数据图6A，b)。
因此，对p53 3KR/3KR Mdm2-/+小鼠定时杂交获得的胚胎进行了检测。到了e7.5天，p533KR/3KR Mdm2-/-胚胎的p53染色显著增加，但发育结构基本正常(图5A)，表明p53 3KR突变导致了胚胎发育的实质性挽救。正如预期的那样，尽管p53 3KR高表达，但p53 3KR/3KRMdm2-/-胚胎没有表现出越来越多的凋亡水平，这表现在没有切割的caspase-3染色(图5A)和阴性的TUNEL信号(扩展数据图6C，d)。
Ki67和BrdU染色水平也表明，p53 3KR/3KR Mdm2-/-胚胎中没有细胞生长抑制(图5A和扩展数据图6D)。进一步的分析证实，在p53 3KR/3KRMdm2-/- 胚胎中，p53 3KR蛋白水平高，没有切割的caspase-3，也没有诱导p21或PUMA(扩展数据图6e，f)。此外，在p53 3KR/3KR Mdm2-/- 胚胎中，我们没有检测到任何与衰老相关的β-半乳糖苷酶活性阳性的细胞(扩展数据图6G-I)，这表明这些胚胎中没有衰老细胞.
然而，slc7a11mRNA在p53 3KR/3KR Mdm2-/-胚胎中的表达被抑制(图5B)，到E11.5天时，p53 3KR/3KR Mdm2-/-胚胎的发育异常变得非常明显(扩展数据图7A)。
为了探讨p53介导的铁死亡是否与p53 3KR/3KR Mdm2-/-胚胎的发育缺陷有关，我们在E5.5天向腹腔注射铁死亡抑制剂FERR-1，并在E14.5天收集胚胎，以探讨P53介导的铁死亡是否与p53 3KR/3KR Mdm2-/-胚胎发育缺陷有关。如图5C所示，FERR-1处理的p533KR/3KRMdm2-/-胚胎在E14.5(II)天显示出明显的器官发生，如眼睛形成和肢体分化，而未处理的p533KR/3KRMdm2-/-胚胎已经大量死亡(I，也见扩展数据图7B)。
回收的p533KR/3KRMdm2-/-胚胎的身体尺寸(从头到尾)也明显大于FERR-1处理后的胚胎，眼睛结构也明显改善(扩展数据图7C，d)。
最近的一项研究发现PTGS2的上调是铁死亡的一个潜在的分子标志物。如图5D所示，Ptgs2在p533KR/3KRMdm2-/-胚胎中确实显著上调，相反，Ptgs2水平在p53-/-Mdm2-/-胚胎中没有受到影响，这表明Ptgs2上调在p533KR/3KRMdm2-/-胚胎中是p53依赖的。综上所述，这些数据表明p53介导的代谢调节作用和铁链细胞死亡在p533KR/3KRMdm2-/-胚胎中观察到的胚胎发育缺陷中起重要作用。
P53介导的ROS反应中的铁死亡
为了在更具生理学意义的环境中评估铁死亡的调节，我们研究了p53 3KR介导的铁死亡细胞死亡是否与ROS应激反应有关。ROS治疗的方法在前面经描述过。如图6A所示，单独p53 3KR诱导或ROS处理均未观察到明显的细胞死亡。然而，值得注意的是，p533KR诱导和ROS处理联合诱导了大量细胞死亡，这一死亡被FERR-1(图6A和扩展数据图8A)或SLC7A11的过表达(图6B)特异性地抑制。这些结果表明，在ROS胁迫下，p533KR的激活导致细胞铁死亡，与细胞周期停滞、衰老和凋亡无关。
最近的研究表明，野生型p53蛋白可以被Nutlin-3激活。在大多数人类癌细胞中，Nutlin-3介导的p53激活可诱导可逆的细胞周期停滞，但不会导致细胞死亡，这可能限制其在癌症治疗中的有效性。因此，我们研究了抑制MDM2是否能调节p53介导的人类癌细胞铁死亡。正如预期的那样，Nutlin-3处理U2OS细胞诱导了高水平的p53表达，而没有诱导细胞死亡的ROS单独处理，没有诱导强烈的p53激活，也没有引起细胞死亡反应(图6c和扩展数据图8b，c)。然而，当同时使用Nutlin和ROS时，观察到大量的细胞死亡(图6C)。细胞死亡反应是p53依赖的，因为它在内源性p53被敲除后被取消(图6C和扩展数据图8C)，细胞死亡再次被铁死亡抑制剂FERR-1拯救(扩展数据图8D)。有趣的是，虽然DNA损伤剂如依托泊苷和阿霉素也能诱导U2OS细胞高水平的细胞死亡，但FERR-1治疗不能抑制DNA损伤诱导的细胞死亡(扩展数据图8e，f)，这表明p53介导的铁死亡是由ROS特异性诱导的，而不是由DNA损伤诱导的。
最后，为了评估SLC7A11在更多生理条件下对铁性下垂的调节作用，我们构建了过表达SLC7A11的转基因鼠，SLC7A11-BAC,虽然SLc7a11-BAC小鼠的表型还需要进一步分析，但我们从SLc7a11-BAC小鼠及其对照仔鼠身上提取了MEF。如图6D所示，SLC7a11-BAC MEF中SLC7A11蛋白水平比对照MEF高约五倍。值得注意的是，用ROS或erastin治疗野生型MEF引起高水平的铁死亡，但在SLc7a11-BAC MEF中铁性细胞死亡在很大程度上被取消(图6e)。综上所述，这些数据表明P53介导的铁死亡是由ROS特异性诱导的，SLC7A11的水平对P53介导的铁死亡反应是至关重要的。
附录：MDM2:
衰老信号通路：
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