近年来研究发现m6A修饰在哺乳动物神经系统的mRNA中普遍存在，在哺乳动物大脑中尤其丰富。亨廷顿病 (Huntington's disease，HD) 是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病，通常发生在中青年时期。西班牙巴塞罗那大学（Universitat de Barcelona）Silvia Ginés团队利用MeRIP-seq等方法研究了m6A RNA 修饰在HD认知障碍中的潜在作用，研究结果发现m6A扰动是HD记忆损伤的一种新机制，鉴定出RNA修饰是HD的潜在治疗靶点。
标题：Altered m6A RNA methylation
contributes to hippocampal memory deficits in Huntington’s disease mice（m6A RNA 甲基化改变导致亨廷顿病小鼠的海马记忆障碍）
时间：2022.07.11
期刊：Cellular and Molecular Life Sciences
影响因子：IF 9.207
技术平台：MeRIP-seq（m6A-seq）
样本：HdhQ7/Q7野生型小鼠（WT）和Hdh+/Q111基因敲入小鼠（KI），有无行为认知训练（WT Naive、WT Trained、KI Naive、KI Trained），3个重复，共12个样本
实验：行为认知训练和评估、立体定向手术与体内病毒转导、整体m6A水平检测、MeRIP-seq测序分析、western blot分析
摘要：
N6甲基腺苷（m6A）调控多方面的RNA代谢，并参与学习和记忆过程。然而，转录后m6A编辑失调对神经退行性疾病中突触损伤的影响仍然未知。本研究作者研究了亨廷顿病（HD）小鼠海马的m6A甲基化模式，以及m6A
RNA修饰在HD认知症状学中的潜在作用。通过m6A免疫沉淀测序（MeRIP-seq）对接受海马认知训练的HD小鼠分析评估m6A修饰水平，并通过亚细胞分离和Western blot分析评估m6A修饰蛋白（FTO和METTL14）的相对水平。进行AAV-shFTO立体定向CA1海马转导，以研究RNA m6A失调在HD记忆障碍中的作用。研究结果揭示了Hdh+/Q111小鼠海马转录组中相关HD和突触相关基因的m6A高甲基化。HD海马的m6A以经验依赖性方式异常调控，从而导致突触组织的重要组分去甲基化。认知训练后，WT小鼠海马中的RNA去甲基化酶（FTO）和甲基转移酶（METTL14）水平受到调节，而在Hdh+/Q111小鼠中没有。此外，海马CA1区的FTO表达抑制使症状性Hdh+/Q111小鼠记忆障碍得到恢复。总之结果表明，差异RNA甲基化有助于促进HD认知症状，并揭示了m6A作为HD新标记物的作用。
实验方法和流程设计
在C57BL/6遗传背景下繁育HdhQ7/Q7野生型小鼠（WT）和Hdh+/Q111基因敲入（KI）小鼠。Hdh+/Q111小鼠在亨廷顿蛋白基因中靶向插入109个CAG重复序列，将产生的多聚谷氨酰胺片段延长至111个残基。6个月大时，Hdh+/Q111小鼠表现出HD样表型，海马长期记忆障碍，8个月大后出现运动协调障碍。为获得年龄匹配的WT和Hdh+/Q111同窝小鼠，将雄性WT小鼠与雌性Hdh+/Q111小鼠杂交，选取每种基因型的雄性用于实验。
用于实验的小鼠连续两天在露天场地适应，第三天将小鼠在OLT上训练10分钟， 30分钟后处死进行海马解剖，用于之后的整体m6A检测、MeRIP-seq和Western blot分析。
诱导海马活动的实验设计示意图
研究结果
（1）Naïve和Trained条件下Hdh+/Q111小鼠海马中m6A水平分布
图1：HdhQ7/Q7(WT)和Hdh+/Q111(KI)小鼠海马在转录组范围内的m6A图谱
（B）5月龄小鼠的mRNA m6A peaks分布Metagene图，peaks在CDS和3'UTR处富集
（C）8月龄小鼠的mRNA m6A peaks分布Metagene图，peaks也在CDS和3'UTR处富集
（D）预测5月龄小鼠中由HOMER鉴定的与m6A
peaks相关共有motif
（E）预测8月龄小鼠中由HOMER鉴定的与m6A
peaks相关共有motif
（F）5月龄小鼠在每种条件下的可重复m6A peaks 数量（左，IDR merge peaks）和m6A修饰RNA数量（右，Tagged genes），IDR表示不可重复发现率（irreproducible discovery rate）
（G）8月龄小鼠在每种条件下的可重复m6A peaks 数量（左）和m6A修饰RNA数量（右）
（2）Hdh+/Q111小鼠海马转录组甲基化改变影响疾病症状前和症状期的突触和HD相关基因
图2：亨廷顿蛋白突变诱导影响突触和HD相关基因的海马m6A RNA修饰改变
（A）Naive条件下，5月龄KI和WT小鼠之间的差异甲基化peaks火山图
（B）Naive条件下，8月龄KI和WT小鼠之间的差异甲基化peaks火山图
（C）5月龄和8月龄的Naive KI和WT小鼠之间差异m6A修饰转录本重叠Venn图，在症状前和症状期阶段之间只有5%差异m6A标记转录本重叠。
（D）UCSC Genome browser可视化指定mRNA代表性差异m6A peaks。
（E）5月龄KI和WT小鼠在5′UTR、CDS外显子、3′UTR、内含子4个转录区域的m6A下调和上调差异peaks分布分析
（F）8月龄KI和WT小鼠在5′UTR、CDS外显子、3′UTR、内含子4个转录区域的m6A下调和上调差异peaks分布分析
（G）5月龄KI和WT小鼠之间差异高甲基化转录本IPA
（H）8月龄KI和WT小鼠之间差异高甲基化转录本IPA
表1：5月龄Naive小鼠与HD相关基因的差异m6A peaks
表2：8月龄Naive小鼠与HD相关基因的差异m6A peaks
图3：行为训练诱导症状期Hdh+/Q111（KI）小鼠突触基因差异甲基化
（A）5月龄时训练的KI和WT小鼠之间的差异甲基化peaks火山图
（B）8月龄时训练的KI和WT小鼠之间的差异甲基化peaks火山图
（C）5月龄时训练的KI和WT小鼠之间的低甲基化转录本IPA
（D）8月龄时训练的KI和WT小鼠之间的低甲基化转录本IPA
（3）症状期Hdh+ Q111小鼠在海马认知训练后表现出异常的m6A去甲基化
图4：症状期Hdh+/Q111（KI）小鼠对行为训练表现出明显的去甲基化作用。
（A）8个月WT小鼠在Naïve和Trained条件之间的差异甲基化peaks火山图
（B）8个月KI小鼠在Naïve和Trained条件之间的差异甲基化peaks火山图
（C）训练后WT和KI中共有和特异性差异高甲基化转录本Venn图
（D）训练后WT和KI中共有和特异性差异低甲基化转录本Venn图
（E）在WT和KI小鼠中鉴定的差异甲基化转录物本中Naïve和Trained条件之间m6A甲基化水平的倍数变化热图。
（F）WT疾病症状期小鼠在Naïve和Trained条件下5'UTR，CDS外显子，3'UTR，内含子区域的m6A
peaks下调和上调差异的分布分析
（G）KI疾病症状期小鼠在Naïve和Trained条件下5'UTR，CDS外显子，3'UTR，内含子区域的m6A
peaks下调和上调差异的分布分析
（H）UCSC Genome browser可视化指定mRNA代表性差异m6A peaks。
图5：训练的症状期Hdh+/Q111（KI）小鼠中突触基因的功能分析和差异甲基化转录本基因富集。
8月龄WT小鼠（A,B）和KI小鼠（C,D）中响应OLT训练的差异高甲基化（A,C）和低甲基化（B,D）基因的突触GO的Sunburst图
图6：Hdh+/Q111（KI）小鼠响应训练的差异甲基化转录本在CA1神经元中富集
8月龄WT和KI小鼠的高甲基化转录本（A）和低甲基化转录体（B）整合，这些小鼠接受了CA1海马转录组数据库的行为训练
（4）海马认知训练后，WT小鼠FTO亚细胞表达受到调控，但Hdh+/Q111小鼠中没有
图7：症状期Hdh+/Q111（KI）小鼠在训练后，m6A修饰蛋白的核和突触后水平没有改变
接受OLT训练的8月龄小鼠海马中核富集（A-C）、突触后（PSD）（D-E）和非PSD（F-G）的METTL14和FTO的Western blot。
（5）抑制海马CA1区域m6A去甲基化可改善Hdh+/Q111小鼠的探索行为和空间记忆
图8：靶向敲除Hdh+/Q111（KI）小鼠背侧海马中的FTO可回复8月龄的空间记忆障碍
参考文献：
Pupak A, et al. Altered m6ARNA methylation contributes to hippocampal memory deficits in Huntington'sdisease mice. Cell Mol Life Sci. 2022 Jul 11;79(8):416.
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