导致间充质干细胞不良事件和功能改变的潜在风险

间充质干细胞(MSCs)是当前再生医学中最受关注的细胞类型之一。

数千项使用间充质干细胞的临床试验已经完成，许多其他试验仍在研究中。

对于大多数治疗应用，MSC都需要体外培养。然而，体外培养条件并不完全等同在生物体内环境，也就有可能影响到MSCs的生物学特性，包括它们的再生能力、免疫调控能力等等。

接下来我们就一起来关注下这些有可能导致间充质干细胞不良事件和功能改变的潜在风险。

介绍

大多数科学报告展示了细胞疗法的积极方面，但是没有介绍可能影响最终产品质量的不良事件。

然而，重要的是，MSC是具有不同再生特性的异质细胞群，这些不同的特性可能影响干细胞治疗的最终结果。

很重要的一个就是MSC的来源和供体的年龄。众所周知，与年轻人和健康人相比，从老年或患病患者中获得的MSCs群体是不同的。

同时由于组织中很少存在间充质干细胞，体外总是需要培养来获得足够的细胞数从而实现临床应用。在体外培养中，多种非生理条件的影响如氧水平、细胞密度、培养基含量、传代次数和增殖衰老，它们一起改变了MSC的方方面面。

MSC在体外培养期间不良事件潜在风险计划

间充质干细胞的多样性

学界认为，MSC多能性不是细胞治疗的关键方面，旁分泌功能是其组织修复的主要路径。然而不同来源的MSC，其细胞的外泌体可能不同。

多项研究表明，分离自患病患者的间充质干细胞可能会释放出对再生过程产生负面影响的因子。

间充质干细胞的临床应用已经实施很多年。

在以往的临床试验（特别是西方国家）中，骨髓来源的间充质干细胞是最常用的细胞类型，但是由于骨髓组织的抽吸是一个痛苦的有创过程，研究人员一直寻求MSCs的替代来源。

近年来，研究表明，与成人来源相比，新生儿组织具有生物学优势，这使得它们成为间充质干细胞的优质来源，新生儿间充质干细胞比间充质干细胞具有更好的增殖能力、更长的寿命和更有效的分化潜能。

然而尚未得到答案的是，是从不同来源获得的MSCs是否代表不同的群体，是否每一种都具有不同的治疗应用潜力。

MSC体外扩增期间的潜在风险影响治疗特性

3D细胞培养

体外培养条件

虽然MSCs几乎存在于所有组织中，但它们在组织中的含量相对较低，大多数临床方案推荐单次2000万到1亿细胞量的治疗。因此，为了获得如此高数量的细胞，必须进行体外扩增。

MSC分离方案依赖于这些细胞粘附到塑料表面的能力，然而，贴壁培养法产生了具有大量祖细胞和其他细胞类型的异质干细胞群。另一种方法是使用机械外植法或用胶原酶进行蛋白水解酶处理来分离MSCs，不过这可能会影响细胞的生物学特性。

最近报道，氧水平也是干细胞生物学中的一个关键因素。间充质干细胞以往的体外培养是处于标准氧浓度(21%)下，研究证实在低氧浓度下培养MSCs可显著增加细胞寿命，限制了氧化应激、DNA损伤、端粒缩短和染色体畸变。

另一个应该考虑的方面是培养试剂，包括蛋白水解酶、培养基和储存试剂对扩增的MSCs生物学特性的影响。培养基中的胎牛血清是有问题的，因为血清中存在的成分和生长因子没有被很好地表征，用于MSC体外扩增的理想培养基应该包含根据细胞类型确定的标准营养物。

另外，在大多数情况下，扩增的间充质干细胞需要冷冻保存，但是保存条件会改变产品的质量。冷冻保存也可以带来许多不良事件，譬如改变MSC表型和细胞功能。最佳的冷冻和解冻温度控制、冷冻保存介质和在液氮中的长期储存是应该考虑的主要关键因素。

由DMSO组成的冷冻介质，尽管对许多类型的细胞有毒性，仍然是最常用的冷冻保存溶液。由于DMSO的毒性，通常需要在移植前进行洗脱。有报道显示，在输注预先冷冻在DMSO中的MSCs后，患者出现短暂的并发症，包括头痛、呕吐和高血压或低血压，其中一些人出现了呼吸和心血管问题。羟乙基淀粉(HES)可能是细胞冷冻保护中DMSO的替代物，然而还需要更多研究。

间充质干细胞增殖受损

培养的MSCs在体外通常具有高增殖特性。

然而，细胞增殖速率取决于许多因素，即MSCs的来源、细胞所处阶段或培养条件。

已有研究表明，与成人来源的间充质干细胞相比，新生儿间充质干细胞具有更高的增殖潜力。

同样地，培养条件可以改变MSC的增殖，细胞接种密度可能对MSC生长有影响。Mareschi及其同事评估了初始细胞密度和培养时间对BM-MSCs形态学、代谢活性和分化潜能的影响，他们发现最佳细胞生长发生在较低的初始培养密度，当高细胞接种密度时，会导致扁平细胞数量增加和细胞低增殖率。

与传统的二维(2D)培养相比，MSC在三维(3D)结构中的培养可以增加其治疗潜力。然而，3D培养的细胞聚集体可以达到很大的尺寸，如果将这种浓缩细胞池注射到组织中可能带来不良反应，譬如肺栓塞或心脑血管梗塞等。此外，3D体中的所有细胞并非都处于相同的分化阶段。

就临床移植而言，去除动物成分的培养基是非常重要的，动物成分即具有病毒传播以及移植受体免疫系统激活的潜在风险的牛血清，自体或同种异体来源的血浆或血小板裂解物代表了比FBS更安全的替代品。Smith团队优化了添加了不同浓度hPL的脐带来源间充质干细胞(UC-MSCs)的GMP扩增方案。他们观察到在富含10%富血小板血浆(PRP)的培养基中培养的间充质干细胞具有最有效的增殖率。不过需要注意的是，研究表明从老年患者获得的自体血浆降低了MSC的增殖特性。

间充质干细胞分化不确定

MSC未解决的分化问题可以分为两个负面影响。一方面，存在MSC不受控制地分化成不想要的细胞的问题，另一方面，存在完全丧失分化潜能的问题。

这个问题可能是由未指定的培养条件引起的，也可能是由于多能间充质干细胞可能因干细胞生态位的不同引发。

一些报告指出了关于移植后MSCs自发分化成未预知的细胞类型。譬如在小鼠心肌病实验模型中证明了间充质干细胞移植到心脏中导致钙化，在高脂血症大鼠间充质干细胞移植后的腹主动脉损伤部位也观察到了钙化现象。它提示医学界，在骨组织以外的组织中注射MSC后可能会发生骨化过程。

间充质干细胞衰老与转化的潜在风险

与其他类型的细胞类似，间充质干细胞存在一定代次的细胞传代后衰老的情况。

许多论文已经证明，MSCs的长期扩增可诱导细胞衰老，这与生长停滞和细胞凋亡以及其“医学”特性的降低有关。

Ko及其同事已经表明，类似于原代组织细胞，脐带血来源的MSCs(UCB-MSCs)在50次群体倍增(PDs)后启动细胞分裂的永久停滞。

MSC衰老的过程也取决于MSCs的不同来源，有研究显示AT-MSCs在第七次群体倍增时出现衰老表型，其特征是细胞形态发生显著变化，细胞凋亡增加。

间充质干细胞的衰老与其功能衰退密切相关。这一过程的特征包括在培养中观察到的表型改变，以及形态学改变、端粒长度减少和MSCs免疫特性降低等等。

另外细胞衰老的另一个潜在风险是可能的致畸能力，这可能来自高度增殖细胞中随机突变的积累。米乌拉及其同事已经表明，鼠间充质干细胞经过多次传代培养后，获得了无限的细胞增殖潜能，并经历了恶性转化，导致静脉注射细胞后在多个器官中观察到纤维肉瘤的形成。在长期培养中产生的这种转化的MSCs表现出累积的染色体异常、增加的端粒酶活性和c-myc表达以及对抗癌药物更有效的抗性。

这些重要的发现证实了最大限度地减少和限制体外细胞操作和培养的公知原理。

间充质干细胞的标记程序可能会影响其功能

使用外源性MSCs的临床应用的一个重要问题是了解移植细胞在受体组织中的命运。

由于这个原因，细胞标记有助于确定在预期作用位置移植细胞的状态。

适当的细胞染色使得能够研究外源性细胞的迁移途径及其在受体生物体中的持久性，并允许可视化细胞分化和监测移植细胞与宿主组织的整合过程或消除过程。

不幸的是，大部分用于外源细胞标记的方法对干细胞并不友好。

标记MSCs的氧化铁(SPIO)小颗粒可能损害细胞生物学的几个方面，即迁移特性和集落形成能力。

在荧光标记领域，细胞标记对MSC生物学的负面影响的例子更多。Gallina及其同事报道，在荧光二氧化硅纳米颗粒(SiO2-NP)MSC标记后，纳米颗粒在溶酶体中积累，与未标记的细胞相比，其数量显著增加。带有荧光蛋白编码基因的病毒转导也可能损害MSC的天然能力，纪等报道GFP转导表达的MSCs集落形成率低，增殖率不稳定。

在其他研究中，在携带GFP的MSCs中，MMP-2基因表达增加，这表明携带GFP的MSCs显示出迁移能力的改变。其他类型的荧光染料，即荧光亲脂性阳离子吲哚碳菁染料(DiI)或溴脱氧尿苷(BrdU)，明显导致细胞活力降低。

也有一些证据表明，放射性标记扰乱了间充质干细胞的增殖率。氟脱氧葡萄糖-18F处理后不久，间充质干细胞增殖速度减慢。

结论

在过去的几年里，干细胞移植作为不同疾病的治疗手段已经取得了相当大的进展。然而，人们必须意识到，尽管在治疗方法中具有巨大的应用潜力，但间充质干细胞也显示出许多局限性。

本文列举了部分与MSC疗法相关的潜在问题和障碍，包括与制造过程和细胞生物学特性相关的风险。

最令人困扰的问题是分离和扩增间充质干细胞的方案在实验室之间差异很大，这可能会显著影响干细胞治疗的有效性。

因此，制定MSC产品的国际标准至关重要，这些产品应按照良好医疗规范(GMP)加工，具有成本效益，临床实用性。只有到那时，干细胞疗法才会成为一种成熟的、被广泛采用的治疗方法。

参考资料：DrelaK, Stanaszek L, Nowakowski A, Kuczynska Z, Lukomska B. ExperimentalStrategies of Mesenchymal Stem Cell Propagation: Adverse Events andPotential Risk of Functional Changes.Stem

Cells Int.

2019;2019:7012692. Published 2019 Mar 6. doi:10.1155/2019/7012692

*内容为【干细胞精研社】原创，转载请注明来源

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