胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）是一种不可治愈的原发性恶性脑癌，具有较高的基因组和细胞间异质性。胶质母细胞瘤患者平均生存期短（14个月），患者间和肿瘤内异质性对GBM靶向和免疫治疗方法的成功开发提出了巨大挑战，因此深入了解GBM细胞与其免疫微环境之间的相互作用至关重要。
本文中，作者采用scRNA-seq技术研究了单细胞分辨率下小鼠GBMs的免疫和非免疫组成，并对起始和进展过程中的人群进行了纵向分析，为GBM治疗的研究提供了潜在的细胞和分子靶点。
文章详情
文章题目：Single-cell RNA sequencing reveals evolution of immune landscape during glioblastoma progression
中文题目：单细胞核RNA测序：揭示胶质母细胞瘤进展过程中的免疫景观演变
发表时间：2022.05
期刊名称：Nature Immunology
影响因子：31.25
实验平台：scRNA-seq、bulk RNA-seq、qPCR
DOI：10.1038/s41590-022-01215-0
研究内容
1、scRNA-seq在GBM中识别肿瘤细胞、间质细胞和免疫细胞
研究首先通过scRNA测序确定GBM中的细胞类型，包括非免疫细胞群（CD45-）以及免疫细胞群（CD45+），在CD45-细胞群中通过Johnson-Verhaak命名法标记了肿瘤细胞群（EGFR+）；通过marker基因的表达量进一步对CD45-以及CD45+细胞群进行分层类聚，确定了Oligodendrocytes(Mog，Plp1)，Microglia(P2ry12，Tmem119)，Astrocytes(Aqp4)以及Perivascular macrophages(Cd163，Mrc1)等细胞类型。
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Fig.1 scRNA-seq鉴定GBM中CD45-和CD45+细胞群
2、不同转录特性的EGFR+细胞定位
为了确定5个转录不同的EGFR+肿瘤细胞簇分布的基础，研究者确定了EGFR+细胞的数量和面积，结果显示从随着时间的推移，多个EGFR+单细胞到小的独立簇到一个可观测量的进展，并且早期和晚期肿瘤中存在多个克隆。Monocle3拟时序分析结果发现，簇10产生了组成簇0、22和24的细胞，而簇5则为独立来源。并且集群0/10和5/24的EGFR信号传导模式是不同的，在0/10簇的细胞中Tgfα表达增加，而5/24簇细胞中Hbegf表达增加 (Tgfα和Hbegf是在癌症不同信号通路中发挥作用的EGFR配体）。在0/10和5簇的细胞中表达差异最大的基因分别是Pdgfra和Lgals1(GaL1)，为了更好地定义这两个细胞群体EGFR下游的信号差异，研究者进一步进行了bulk RNAseq、GO富集分析以及Reactome分析，结果显示在PDGFRA+细胞群中，上调的基因涉及少突胶质细胞的分化，并且EGFR+PDGFRA+细胞中的神经元系统、突触功能和突触处的蛋白质相互作用明显增强。
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Fig.2 GBMs由转录特性不同的EGFR+癌细胞群体组成的
3、GBMs含有一个增殖的小胶质细胞种群--显示出促炎特性
小胶质细胞簇19的G2M和S期细胞周期基因表达水平较高。流式细胞术结果显示，与对照组相比，在GBM进展期间GBM小鼠EdU+小胶质细胞在GBM组织中特异性增殖。EdU+GBM小胶质细胞含有与有丝分裂、细胞周期相关的上调基因，EdU-小胶质细胞表达与炎症反应、细胞因子反应等有关的基因。在GBM中，循环小胶质细胞与非循环小胶质细胞的转录组具有差异，后者与促炎极化有关，并且GBM会刺激远处小胶质细胞。拟时序分析发现簇2由簇4分化的观点，进一步分析两簇差异基因，发现簇4是更活跃的小胶质细胞吞噬群。综上所述，在GBM肿瘤微环境(TME)中，存在一个小胶质细胞亚群通过增强促炎反应对肿瘤做出应答。
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Fig.3 EGFR GBMs中存在增殖的小胶质细胞
4、大多数GBM细胞因子来源于瘤内免疫细胞
通过RTqPCR分析小鼠GBMs CD45+和CD45-中的32种细胞因子的表达，结果显示大部分细胞因子在CD45+细胞中表达。同时发现大多数检查点转录本也在CD45+细胞群中表达，具体主要在T细胞和髓系细胞中表达。总之，这些结果表明，检查点受体除了存在于T细胞外，还存在于先天免疫细胞；大多数瘤内细胞因子表达更多来自CD45+细胞，较少来自癌细胞。
# Fig.4细胞因子、检查点受体及其配体主要在瘤内CD45+免疫细胞中表达
5、肿瘤进展过程中GBM TME的纵向演变
通过RNAseq显示，EGFR+细胞在早期和晚期GBMs中显著增加。通过流式细胞术分析细胞类型，结果发现早期小胶质细胞占比高，而晚期巨噬细胞浸润增加；随着时间推移，GBMA中对侧脑组织中巨噬、淋巴、单核和NK细胞明显减少。细胞拟时序分析显示，簇9来源于簇12，并且仅出现在GBM中。簇12富含少突胶质细胞髓鞘化和分化发育相关基因，簇9优先表达有氧呼吸功能基因，表明新衍生的少突胶质细胞能量需求发生变化。
# Fig.5免疫细胞浸润随时间的动态变化
6、在GBM进展过程中先天免疫的变化
与正常大脑相比，早期GBM中小胶质细胞簇2中促炎生物标志物以及中性粒细胞趋化及吞噬作用的表达，表明早期GBM激活小胶质细胞的促炎反应。随着时间推移进展，BAM（13）获得了中性粒细胞趋化、血管生成和炎症反应相关基因的表达，巨噬细胞和小胶质细胞失去促炎极化。
# Fig.6 随时间推移，巨噬细胞和小胶质细胞失去促炎极化
7、TMZ调节PMN-MDSCs、巨噬细胞和小胶质细胞，延长生存期
高剂量的TMZ可能会通过增加小胶质细胞以及减少PMN-MDSCs和巨噬细胞的抑制群体，促进一种促炎表型，然而这并不足以诱导肿瘤清除，这表明缺乏适应性反应和耐药性机制的发展。
# Fig.7 TMZ改变GBM免疫微环境，延长生存期
主要结论
本文通过scRNA-seq和流式细胞术对基因工程小鼠正常大脑和GBM两个发展时期的样本进行分析，揭示了整个肿瘤过程中免疫细胞组成的大规模、全面的纵向变化。随着GBM发展，发现GBM中存在一个高度增殖的小胶质细胞群体，并且大部分细胞因子及其受体在免疫细胞中表达，很少来自EGFR+癌细胞；在晚期的肿瘤中发现了抗炎的巨噬细胞和致癌原细胞。髓源性抑制细胞，这种演变与血脑屏障的破坏和表皮生长因子GBM+细胞的广泛增长相一致。IR/TMZ治疗能够通过促进效应CD8T细胞功能，提高生存期。本研究结果为GBM进展过程中免疫和非免疫细胞的动态变化提供了一个新的的视角，也为疾病的治疗指明了新的方向。
参考文献
Yeo, Alan T et al. “Single-cell RNA sequencing reveals evolution of immune landscape during glioblastoma progression.”Nature immunology vol. 23,6 (2022): 971-984. doi:10.1038/s41590-022-01215-0
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