一般Taqman定量PCR实验过程为：
目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。
第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。
第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：
总体原则
先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。
所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。
扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。
保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。
为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）
将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
引物设计原则
序列选取应在基因的保守区段
避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构
典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
引物之间的TM相差避免超过2℃
引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基
为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp
引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
探针设计原则
探针位置尽可能地靠近上游引物
探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性
检测探针的DNA折叠和二级结构
Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%
探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
Taqman MGB 探针设计
探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
Tm值应为65-67℃。
尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于13bp。
尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上的G重复出现。
原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。因此，在进行SNP检测时，为了检测到突变子，即Taqman MGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。
注意：为了满足上述要求的4个条件，探针的突变位点可向3’端移动，但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守)，以进行SNP检测。反过来，若要进行同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。若探针即便是只有13个bp，探针仍不完全保守。有几个突变，突变位点也应靠近探针的5’端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。另一种方法是设计简并探针，也可达到即使是突变，仍可检测到突变。
第三步：寻找一家信赖的公司合成引物和探针，一般引物合成大家比较熟悉，而且价格也比较便宜（特别是这两年便宜了许多），而探针则相对来说贵了许多，一般Taqman探针合成在1000到5000元不等（不同的合成要求价钱不同）——而这只是标记价钱，序列合成基本上和引物合成价钱相似。
第四、五、六步：一般的定量PCR反应体系与普通PCR其实也差不了多少，只是要加入Taqman探针，另外不同就是分步法的不同。其中需要注意的是：
扩增酶最好选用热启动酶
引物和探针的浓度需要进行优化，有人建议从50nM开始，在50nM—900nM之间优化，一般为200nM（注意探针需要避光保存。
同样Mg+和酶量也需要进行优化，酶的推荐反应浓度是1.25-1.5U（50ul）
DNA模板的添加量通常在100 ng以下，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。如果欲进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。
另外循环参数虽然在引物和探针设计完之后也就确定了，但是有时也需要进行优化。
第七步：在进行数据分析的时候，通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。方程式的斜
度可以用来检查PCR的效率，对于100%PCR效率来说，一个理想的斜率是3.32。最佳的标准曲线是建立在PCR的扩增效率为90%-100 %(100%意味着在每个循环之后，模板的总数将增加为前一次的2倍)的基础上。所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R2≥0.99) ，这样才能认为实验的过程和数据是可信的。使用这个方程式我们可以计算出未知样本的初始模板量。大多数定量PCR仪都有这样一个软件，它可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
这其中有两种基本的方法：绝对定量和相对定量，研究人员需要根据自己的实验目的来选择。绝对定量是指将未知样品与标准曲线相比较进行分析，一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品，要注意得是绝对定量分析的准确性是相对标准品的准确性而言的。相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率，没有确切的数字被检测道。
另外由于不同的样品在反应过程中存在着一定的差异，因此除了要制作标准曲线来进行定量外，还需要设计表达水平相对较为稳定的内参基因来对结果进行标准化。β-actin 和三磷酸甘油醛脱氢酶( Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH) 是两种较常用的管家基因，另外还有cyclophilin，18sr RNA ，phosphoglyserokinase，beta-microglobulin，beta-glucronidase，hypoxanthine ribosyl transferase，transferring receptor 等。要注意这些基因可以被反应条件所影响，在设计定量表达研究时，保证初始对照基因的质量是必要的一步，而且严谨的研究人员会通过对一系列内参基因定量结果取几何平均数来对定量数据进行标准化。
还有一个问题就是如何判断所得到数据的好坏，关于扩增曲线，经验总结认为：
“1. 总体看曲线拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性极好，基线平无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。
-
曲线指数期斜率，反应了扩增效率，越大说明扩增效率越高。扩增效率越高，试剂灵敏度表现会越好。
-
基线，图上的基线也就是阴性样本的扩增曲线，平直或略微下降是好试剂的表现，阴阳性清楚，不易误判。如果有上扬趋势，有可能造成阴性标本误判。
-
曲线与曲线间平行性非常好，说明各反应管扩增效率相近，外标准定量建立在每管扩增效率一样的假定基础上，所以扩增效率越相近，定量的重复性和准确性就越好。而扩增效率相近与否，反应在扩增曲线图上就是曲线的平行性。
-
低浓度曲线指数期明显，一方面不易出现假阴阳性误判，另一方面说明灵敏度高。”
实验方案的优化
Mg2+的浓度
Mg2+的浓度是影响Taq酶活性的关键因素，Mg2+浓度过低可影响Taq酶最佳活性的发挥，Mg2+浓度过高，会增加非特异性扩增。
一般来说，以DNA或cDNA为模板的Real-time qPCR反应，应选择2～5mmol/L的Mg2+浓度，以mRNA为模板直接进行的反应，应选择浓度为4～8mmol/L。
模板的质量和浓度
模板的浓度应根据Ct值进行选择，一般而言，使Ct值位于15～30个循环之间比较合适，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果Ct值小于15，则应降低模板浓度，如果研究者是进行首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验，以选出最为合适的模板浓度。
PCR抑制
对于一些成分复杂样本（土壤、沉积物等）的Real-time qPCR反应，此时提取的DNA模板中通常含有较多的腐殖质等物质，其会抑制PCR反应，导致扩增效率下降，从而使对目的基因的定量准确性降低。
通常采用用对DNA模板进行稀释的方法消除PCR抑制，但是某些情况下，由于模板量较少，稀释的办法并不适合，就需要对模板进行额外的纯化。
引物浓度和纯度
引物浓度太低会致使反应不完全，若引物浓度太高，则发生错配，并产生非特异性的扩增产物。对于大多数PCR反应，0.5μmol/L是适宜的引物浓度，若初次实验结果并不理想，可在0.3～1.0μmol/L之间进行调整。
Real-Time qPCR所用引物的纯度至少要达到PAGE级，如使用OPC级引物会造成结果的不准确。
引物二聚体
image
通常目的基因PCR产物熔解曲线的峰出现在80～90℃之间，当熔解曲线在70～80℃范围内出现一个荧光强度较小的峰时，表明Real-time qPCR反应有引物二聚体生成。
此时首先要判断引物二聚体产生的原因，如果在高目的基因拷贝样品中没有出现引物二聚体，而只在低目的基因拷贝样品中存在引物二聚体，此时引物二聚体的出现是由于样品中目的基因含量过低，导致引物过量而发生自我匹配，可以通过增加模板使用量或减少引物使用量的方式消除引物二聚体。
另一种消除引物二聚体的方式是提高退火温度，但是并不是一定有效，建议在进行Real-time qPCR之前最好通过温度梯度PCR的方式检验引物是否会形成二聚体，同时确定合适的退火温度。
扩增效率
在绘制目的基因标准曲线时，经常会遇到扩增效率偏差较大的问题。
可以在反应体系中添加500μg/mL的BSA（牛血清蛋白），BSA能够稳定低浓度的核酸模板，同时提高扩增效率。
短的PCR产物比长的PCR产物扩增效率高，这是因为短的产物在95℃时更易变性，使引物和探针在退火阶段更有效地与其互补序列结合，降低来源于基因组扩增的污染，同时缩短了扩增时间。
提高退火温度可以提高PCR反应的特异性和扩增效率，必要时可以将退火温度提高至60℃以上，并去除72℃的延伸阶段，将退火和延伸合并为一个阶段进行，以保证目的基因的扩增效率。
如标准曲线的扩增效率高于100%较多，多数是由于标准品梯度稀释过程中操作失误，导致稀释倍数较多的低浓度标准品不准确，应重新对标准品进行稀释后再次绘制标准曲线。
参考：生物通
网友评论