【现学现卖】近期的长克隆实验小总结

​兑现之前的承诺，来说一下之前的实验结果。

由于之前感兴趣的那个病毒的已知序列信息较少，所以不得不做大量的克隆来获得全部，包括末端序列的信息。通过对已知部分序列比对，它和FgHV2（12,000bp）的病毒同源，很可能也是个1万多bp的病毒。

知道它很长之后，我内心是抗拒做一点一点的克隆的，因为实验室测序，订新引物的速度都太慢了，想着有没有一个方法，可以一次克隆一个长长的序列？

于是就有了以下设想，利用long RCR和dsRNA，理论上可以得到全长的克隆。以下几篇推送文章可以回顾。其中电转中的失败我现在认为是那个promega试剂盒Long PCR MasterMix的盐太多了，因为每次纯化它的PCR产物都有很多白白的沉淀，用它再做连接和电转就一定会因为盐过高而【crack】一声，所以每次抽提醇沉的时候都洗得更加干净才行。

【现学现卖】用更少的克隆得到更长的序列

【现学现卖】PCR ramp rate

【现学现卖】电转染中令人心碎的crack声

但是理论终归是理论，尝试了一个月，现实还是非常骨感。

蓝白斑平板第一天几乎没有白色菌落长出来，第二天长出来了好多，侥幸以为是插入片段太大了，所以细菌会长的慢。

后来发现新长的白色菌落很多不含amp抗性，极少数可以用LB+Amp摇培出来的细菌，用它提取质粒，EcoR1酶切都很正常，但是用M13F引物测序总是质量特别差。推测可能时间长了，长出来了抗amp的菌，但是并不是我们想要的质粒和插入序列。

上周设计了一些特异性引物，准备一段段克隆的同时再想想长克隆有没有其他可以改进的地方。可能是pGEM-T easy质粒的问题，克隆长片段有些困难，但是目前实验室也没有其他载体可以让我尝试了，再想想吧。

这就是实验生活呀，有兴奋得想天天泡在实验室的时候；也有被现实泼了冷水，不得不重新思考，从头再来的时候。