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5.1 原核与真核生物复制叉的区别Prokaryotic Verus Eukaryotic Replication Forks

原核与真核生物复制叉的区别

5.2 DNA起始的介绍

origin of replication: DNA开始解链以及DNA开始合成的物理位置

origin efficiency: 细胞分裂时复制起点启动的百分比

复制子replicon: 源于一个起点的复制叉生成的全部DNA区域

复制子模型replicon Model=复制基因replicator+起始子initiator
复制基因replicator: 启动染色体复制所必须的DNA序列。它不等于复制起点。
起始子initiator:能够识别复制基因，从而激活复制起始的蛋白质

5.3 Cell Cycle Terms

5.4Cell Cycl

5.5 复制起点Origins of Replication

发生于细胞分裂周期的S期。

复制起点。大肠杆菌只有一个；人类有约30000个复制起点

5.6High Throughput Assays for Origins of Replication

如何寻找复制起点？

• map long leading strand DNAs

5.7DNA Sequencing and Interpreting Results for Nascent Leading Strand Detection新生的前导链检测

对生成的新生的前导链检测进行深度测序
优点是不需要先验知识
缺点是分辨率低

5.8Nascent Okazaki Fragment Origin Mapping

构建新生的冈崎片段图谱，也是用于寻找复制起点的方法

需要将单链转换为双链进行测序

5.9Analyzing Nascent Okazaki Fragment Origin Mapping Data

怎样解释上一节的数据？

6.1复制时序分析Replication Timing Assays

也是用于寻找复制起点的方法。

6.2Replication Timing Assays Continued

6.3 定位复制基因方法一：基于质粒的方法

用限制性内切酶EcoR1将质粒的复制基因除去 质粒上同时带有遗传筛选的selectable marker；用ECOR1酶切genomic DNA成为片段，然后把这些片段连接到质粒上 由此可以构建携带不同片段的质粒，称为基因文库library，之后将其transform进入宿主细胞，然后放入培养皿中进行遗传筛选；比如marker 基因是ura3, 则放在缺乏uracil的培养基中，则只有携带ura3+复制基因的质粒的细胞能存活，将这些存活的细胞菌落拿去测序。那么复制基因比如包含在细胞内的质粒当中

6.4 定位复制基因方法二：突变定位。实现对复制基因的准确定位

第一行是包含复制基因的DNA，将其分段突变如下面所示。然后测其replicator activity, 发现方括号内的基因没有活性，所以这两块基因是复制基因所necessary的，再单独表达这两块基因如最后一行所示，若有活性，则说明是sufficient的

6.5 Isolating and Identifying Replication Proteins

对于origins of defined sequences来说，包含两个组分： 、

起始子结合位点replication initiation site+一段DNA容易解链的区域easily unwound DNA；真核中还包含第三个组分：核小体

三种生物的replication initiation site、easily unwound DNA和initiator binding site

那么如何鉴定DNA复制蛋白呢？第一种方法如下

从活细胞中提取蛋白复合物，经过阴离子交换anion exchange，经过梯度分离获得A、B、C、D四个组分，将其自由组合，发现A+B+D可以激活复制，而它们也是混合物，需要进一步细分，以B为例，如下图所示 将B细分为B1、B2、B3、B4四份，发现A+B2+B3+D可以发挥作用，再次细分B2，依次循环

鉴定DNA复制蛋白的第一种方法比较复杂，第二种方法是采用遗传筛选鉴定DNA复制相关蛋白