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（最近在准备托福考试，出现的英文比较多，纯手打，为了训练一下，祝我好运呀~）
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Q: why choose this paper?
How to find crosstalk between different pattens(like
DNA methylation,histone modification,noncoding RNAect) is the hot research area in epigentic.
【如何寻找表观领域当中不同修饰（如DNA甲基化，组蛋白修饰和非编码RNA等）之间的联系是表观遗传领域研究的热点】
We may have some knowledge about many DNA mehtylation in promoter region will cause gene silence,as well as some histone modification(like H3K9 methylation); But some DNA methylation and histone modification will activate gene expression （expecially some cancer suppress gene）
【我们一般知道启动子区的高DNA甲基化和一些组蛋白的修饰会变造成基因的沉默，但是也有一些DNA甲基化和其他组蛋白修饰会促进基因表达比如说一些抑癌基因等等】In this paper, the author found a crosstalk between DNA methylation and histone modification, what's the mechanism? How to prove it？
【这篇文章中，作者找到了一些DNA甲基化和组蛋白修饰之间的联系，机制是什么？如何去证明的？】
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Summary:
1：depletion of KDM2A will cause genome 5hmc increase and TET2 expression incerase.(如果敲减KDM2A会导致5hmc的水平上升，TET2的表达上调)
2：KDM2A can recruit RelA to occupy the TET2 promoter region（KDM2A可以招募到RelA去占领TET2的启动子区域）
3：upregulate the TET2 will increase the EpCAM,E-cadherin expression and decrease the invasion and migration in triple-negetive breast cancer(在三阴性乳腺癌中，TET2的上调可以导致下游的上皮因子和钙黏连蛋白的表达增加抑制肿瘤的侵袭和转移。)
Background:
We all know DNA methylation and histone modification can cause oncegene and tumor suppress gene aberrent expression.During their previouly study, they found KDM2A( lysine demethylase 2A) can lead tumor stemness and angiogenesis through Notch signaling.
【DNA甲基化和组蛋白修饰会导致原癌基因和抑癌基因的异常表达，之前的工作基础发现KDM2A可以是一个肿瘤的原癌基因，通过Notch信号通路导致肿瘤的干性和侵袭】
Result:
一：KDM2A inhibits the expression of TET2 to increase DNA methylation
(KDM2A抑制了TET2的表达从而影响了DNA甲基化的水平)
思考一下：1：如何去证明KDM2A可以影响TET2的表达？
2：DNA甲基化的水平如何去体现呢？
图一：KDM2A抑制了TET2的表达从而增加了DNA甲基化的水平
1.a KDM2A在不同的乳腺癌细胞系里的表达情况，可以看到231,578细胞系当中表达比较明显（他们是首先用细胞裂解液去裂解然后提蛋白，用KDM2A抗体杂出来的带，下面的是内参）
1.b 他们构建了一个231-2A2的敲减细胞系（231-KDM2A敲减）的细胞系，然后他们比较了基因组的5hmc的情况，发现了有显著的差异（以231的表达基质定为1，算表达倍数）
1.c 他们进一步看一下这个5hmc的表达差异是不是由TET酶的表达差异引起的
1.d因为5hmc是由5mc经过TET酶催化而来，所以来看一下到底是那个TET酶起作用，结果发现是TET2。然后还在不同的细胞系当中做了一个验证。
1.f 因为是在KDM2A的敲减细胞系中看到了这个现象，为了证明KDM2A是和TET2的表达相关，然后在敲减的细胞系中加入了KDM2A转染质粒，看看TET2的表达情况，来证明KDM2A和TET2的表达相关性
1.g 然后在231-2A2的细胞系里面加了TET2的siRNA,发现5hmc也下降（和对照比）
思考一下：证明了KDM2A可以影响TET2的活性了，进一步去挖掘一下机制，如何去挖掘？
二：Repression of TET2 by KDM2A is RelA-dependent
(KDM2A是通过RelA去影响TET2的活性)
因为KDM2A是组蛋白H3K36的去甲基化酶，而且会用利用特殊的锌指结构域去识别CpG 区域的甲基化和未甲基化区域，然后对甲基化区域进行去甲基化。而且H3K36在启动子区域的甲基化会影响基因的表达，当启动子区高甲基化时会促进基因表达，当低甲基化时会抑制基因表达。
图二：KDM2A依赖于Rel-A导致TET2的抑制
2.a 为了确定是TET2是KDM2A的靶标然后设计了一个ChIP实验。发现了，KDM2A可以增加H3K36 2/3甲基化的水平。
2.b 利用生信预测一下4个不同的Rel-A的结合位点，并且找到了2个结合相关性很强的位点（因为之前有实验室已经报道了Rel-A可以去结合人类的TET2的启动子，并且在三阴性乳腺癌中RelA可以结合一些基因刺激/抑制雌激素受体的表达。）
2.c 把RelA通过RNAi的方式沉默掉，发现了H3K36me2,H3K36me3上升，KDM2A的水平下降了
2.d 在转染shRNA后48小时WB的结果，发现RelA下调，然后TET2上调，KDM2A下调。 EpCAM（上皮粘附因子） ，E-cadherin （钙黏连蛋白）上调。
通过细胞学实验，证明了是通过影响RelA的结合情况来影响基因表达的，但是有意思的发现是发现了下游的蛋白表达情况出现了变化，而且这两个蛋白和肿瘤的侵袭和转移有关系！所以把关注重点放在了这两个蛋白上面
三：Increase of TET2 expression induced by KDM2A depletion promotes the re-activation of the downstream target genes to suppress cell invasiveness
因为KDM2A的下调增加TET2的表达会刺激下游的一些靶基因的表达从而抑制肿瘤的侵袭和转移
图三：因为KDM2A的下调增加TET2的表达会刺激下游的一些靶基因的表达从而抑制肿瘤的侵袭和转移
3.a 用了3个不同的乳腺癌细胞系（231,468，Hs-578T），加了KDM2A的shRNA，后的 EpCAM（上皮粘附因子）的表达情况,发现利用RNAi干扰以后的上皮粘附因子表达都上调了。
3.b 231，231-2A2,231-2A2- TET2(RNAi)的EpCAM RT-PCR的结果。
3.c 231，231-2A2,231-2A2- TET2(RNAi)的不同蛋白的表达情况，辅助一下b图的结果
3.d HS-578T +/- KDM2A shRNA后TET2,KDM2A,EpCAM,E-cadherin 的表达情况，Actinin是内参
3.e ChIP下游引物的设计情况，KDM2A的下降增加了TET2的CpG结合能力。
3.f 231,231-2A2 的5hmc的富集情况（证明了KDM2A的敲减上调了TET2的表达，诱导了EpCAM 的去甲基化刺激了基因的表达）
3.g 细胞的迁移能力（当把KDM2A敲掉后，细胞侵袭的能力下降了，但是把KDM2A敲掉了，加入了TET2的siRNA,细胞的侵袭能力上升。这个实验重复了3次）
3.h MDA-MB-231 和 MDA-MB-231-2A2 用IgG和抗EpCAM的抗体去做ChIP,然后看侵袭能力。
在证明了确实KDM2A可以通过TET2可以影响到下游的靶基因的表达，从而影响了细胞的侵袭转移能力。（按照科研套路肯定要上生存曲线了~）
四：TET2 expression is inversely correlated with KDM2A and predicts a better survival in the triple-negative cancer patients
（TET2表达和KDM2A表达呈负相关，并且可以预测三阴性乳腺癌的生存率）
主要的想法就是去寻找一些临床数据然后进行上述结果的验证
TET2表达和KDM2A表达呈负相关，并且可以预测三阴性乳腺癌的生存率
4.a 在肿瘤组织当中的KDM2A高表达和TET2低表达的组织切片的样子。
4.b KDM2A和TET2的表达相关系数此外，肿瘤的大小不太一样。（他们自己定了一个H-Score：h值=ΣPi (i + 1),i是肿瘤细胞的染色强度(0到4 +),pi为每个强度颜色肿瘤细胞的百分比。）
4.c 在不同肿瘤大小的情况下TET2表达的情况
4.d 是把这些肿瘤样本的情况划分了一个等级
4.d 淋巴结的肿瘤TET2表达情况
4.f TET2的表达情况和乳腺癌患者的生存曲线
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这篇文章发在了Oncegenes 上，逻辑挺清楚的，层层递进的感觉，很容易看懂。但是还是有一些不足，比如说5hmc上升后有没有其他的一些效应，是否还有别的表观修饰呢？因为KDM2A是一个组蛋白去甲基化酶，当发生去甲基化后，DNA甲基化的水平变化情况怎样呢？如果DNA甲基化的水平增加了的话还会有哪些其他的影响？
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