测序

测序简介

1. 一代测序（Sanger测序）：利用DNA聚合酶合成反应的测序技术

70年代的Sanger发明“双脱氧终止反应法”，利用双脱氧核苷酸 ddNTP去摸索DNA分子。

Sanger测序原理：

在合适的条件下，当DNA模板、引物及脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在时，DNA聚合酶能够催化DNA链的合成。ddNTP是双脱氧核苷三磷酸，其C3位上连的是脱氧后的羟基。在一般情况下，C3位上-OH作为下一个dNTP连接的位点，因此失去氧原子的ddNTP不能与下一个dNTP连接，从而终止DNA链的延伸。用放射性同位素标记ddNTP，同时往正常的PCR反应里分别掺入ddNTP（ddATP，ddTTP, ddCTP, ddGTP）。
当ddNTP结合时，DNA合成终止，因此DNA合成链可能随机停止在任何碱基处。经过几十个循环后，将得到长短不一且长度相差一个碱基的DNA产物，将所得产物分四个泳道进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据四种碱基的条带位置反向推出DNA序列。
引自：https://zhuanlan.zhihu.com/p/34831800

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2. 二代测序

二代测序基于大规模平行测序技术（massive parallel analysis，MPS），它能同时完成测序模板互补链的合成和序列数据的获取。Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa/Hiseq技术和ABI公司的SOLID技术标志第二代测序技术诞生。
一般来说，二代测序技术包括三个连续的步骤：1.往测序反应中加入dNTP；2.检测加入到测序过程的碱基类型；3.去除反应中的各种酶、荧光标记物或dNTP 3’端的阻碍基团等洗脱反应。

引自生信星球

3. 三代测序

三代测序则基于单分子测序和大规模平行测序技术。目前比较知名的是Oxford Naropore公司的单纳米孔测序，和Pacific Biosciences的单分子实时测序两种平台。
目前比较知名的是Oxford Naropore公司的单纳米孔测序，和Pacific Biosciences的单分子实时测序两种平台。PacificBiosciences推出的单分子实时（single molecular real time, SMRT）DNA测序技术被称为三代测序，它以SMRT Cell作为测序载体，也是基于边合成边测序的原理。
https://zhuanlan.zhihu.com/p/34831800