不知不觉中,2021年又离我们而去，这篇稿子跟大家见面的时候，应该是在22年的清晨，首先跟大家说一句新年快乐！
为便于阅览，特整理行文脑图如下，字数较多，建议先马（mark）后看
再回首 ▏m6A的2021
去年生信人公众号经过一次热点年度的盘点，十大热点。但是如果把这个年度热点的标准放在文章发表量上看的话，想蹭热点的话还是应该选择m6A。Pubmed中检索“m6A”关键词，有1400多篇。其发文程度跟ceRNA不相上下。
说句题外话，就是哪个烂大街的ceRNA，21年也发表了1400+篇。所以课题思路很重要，技术路线是服务于课题思路的，所以说不要听别人怎么说，要看数据说话。
从图中还可以看到m6A近几年开始热起来，并且大有赶超ceRNA的趋势。但是还没有到卷起来的状态，根据趋势粗略估计明年至少1400+的m6A相关的文章。好了，既然m6A这么火，那么我们应该如何利用这个还在风口去发一波文章呢。
在新年的第一天，带你再次全面的了解下m6A，文章总共分为三个部分，第一个m6A的背景介绍和跟肿瘤的关系，第二部分是目前常见的m6A研究思路有哪些，包括纯生信挖掘和实验，第三部分是针对m6A研究衍生思路或者技术路线有哪些。由于本文内容较多，建议大家收藏后，慢慢吸收，另外由于创作不易，欢迎大家给个小爱心。
遇见 ▏m6A背景介绍
一、m6A简介
N6-腺苷酸甲基化(m6A, N6-methyladenosine )是1974年首次发现的一种著名的转录后修饰，一直被认为是在从病毒到哺乳动物的mRNA中发现的最频繁的内部修饰，但在许多真核生物物种的小ncRNA和lncRNA中也会出现，并且这种修饰富集在3′非翻译区(3′UTRs)、停顿密码子附近、长内外显子内、基因间区、内含子和5'UTRs处。m6A检测的大多数方法依赖于使用识别m6A的特异性抗体免疫沉淀甲基化RNA，随后利用紫外线交联步骤将甲基化RNA与抗体结合的改进方法，使得能够在单核苷酸分辨率下识别m6A位点。m6A修饰也可发生在ncRNA中，如miRNA、lncRNA和circRNA。在miRNA中的m6A修饰在pri-miRNA中，但不在pre-miRNA中，而且m6A标记通常位于基因间和基因内包含典型METTL3基序的pri-miRNA中。至于circRNAs，尽管来源于mRNA外显子，但m6A修饰的circRNAs经常来源于mRNAs中未有甲基化的外显子。LncRNAs中的m6A沿着转录本的整个主体分布，并且在经过可变剪切的lncRNA中存在较多。
i)m6A的编码器(Writer)在转录过程中，m6A的沉积发生在新生的pre-mRNAs中，由甲基转移酶复合物在细胞核中进行。复合物包括METTL3、METTL14、RBM15、WTAP和KIAA1429，其中METTL3通过其甲基转移酶域催化腺苷向m6A的转化，METTL14负责识别RNA底物，RBM15负责复合物在mRNA中靶位点的初始招募，WTAP和KIAA1429负责复合物的形成。最近的研究还发现了ZC3H13在适配体RBM15和WTAP之间起桥梁作用，METTL16是人类细胞中另一种活跃的m6A甲基转移酶，其主要能甲基化snRNA、pre-mRNA中的一些内含子位点，此外还能甲基化其他ncRNA。
ii)m6A消码器(Eraser)m6A的沉积是可逆的，依赖于特定甲基转移酶和去甲基酶或“Eraser”的协调和动态网络。目前m6A甲基酶有FTO和ALKBH5，其中FTO表现出对2 ' -二甲基腺苷(m6Am)脱甲基化的偏好，但也能脱甲基化m6A。此外， ALKBH3优先作用于tRNA中的m6A。
iii)m6A读码器(Reader) m6A Reader结合蛋白的独特识别元件，驱动标记RNA发生的生化过程。部分Reader含有一个共同的RNA结合域--YTH域，其中包括YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3。此外，还有eIF3、HNRNPC、HNRNPA2/B1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、PRRC2A和 FMRP等。
二、m6A的沉积作用
i)m6A在RNA中的作用
m6A在mRNA中的作用关于m6A沉积的生物学功能，依赖于识别和结合修饰过的mRNA的蛋白质reader。例如，YTHDC蛋白亚型主要存在于细胞核中，特别是YTHDC1已被描述为pre-mRNA的可变剪切因子，其通过招募核转运受体或与m6A甲基转移酶结合TREX mRNA输出复合物和修饰mRNA来促进mRNA输出。而YTHDF蛋白亚型主要存在于细胞质中，并调节细胞质修饰的mRNA的结局。例如，YTHDF1和YTHDF3可以提高mRNA的翻译效率，YTHDF2通过CC4-NOT脱乙酰酶复合物促进mRNA的衰变。YTHDF3也可能通过与YTHDF2相互作用加速mRNA的衰变。YTHDC2蛋白可以存在于细胞核内外，能够选择性地与ncRNA的m6A标记结合，但结合后的生物学后果还尚不清楚。在胞浆中，YTHDC2影响其靶mRNA的翻译效率和丰度。迄今为止的证据表明，m6A沉积通过复杂的reader网络介导不同的效应，但最近的一项研究揭示了m6A的 reader统一功能模型的证据，m6A主要通过三个YTHDF成员reader的共同作用影响mRNA的降解。除此之外，研究也表明eIF3蛋白优先与mRNA的5′UTR内的m6A结合，导致翻译增强，IGF2BP能促进其靶向mRNA的稳定和储存。
ii)m6A在ncRNA中的作用与mRNA相似，miRNA、lncRNA和circRNA上m6A的存在可以调节它们与m6A-reader的结合，进而调节它们的加工和成熟、丰度、翻译、稳定性、位置、功能或降解，也可以动态调节包括肿瘤发生在内的许多生理和病理过程。例如，METTL3对pri-miRNAs的甲基化可增加其与HNRNPA2/B1的结合，使DGCR8与pri-miRNAs发生相互作用并使之成为靶标，促进miRNA生物发生的启动及其成熟为miRNAs。METTL14可以直接将DCGR8招募到编码miR-126a的m6A修饰的pri-miRNA上，进而影响miR-126a的水平。此外，METTL14被发现在转录伸长过程中与染色质相关，这可能表明METTL14可能有助于复合物对pri-miRNA转录物的协同转录招募。因此，通过甲基化酶或Eraser差异表达改变m6A水平可能导致成熟mirna的显著变化。正如最近报道所述m6A沉积可以改变lncRNA的稳定性。GAS5-AS1转录被ALKBH5调控时，m6A可提高其稳定性，然而m6A可通过YTHDF2和YTHDF3结合促进GAS5 lncRNA降解。虽然目前还不清楚lncRNA的定位是否也受m6A的调控，但已有研究表明，METTL3的过度表达可以显著增加RP11 lncRNA的核定位。lncRNA中m6A的修饰也可以影响其结构，影响RNA之间以及RNA与调节其特定生物学功能的蛋白质之间的相互作用。例如，发现HNRNPC与lncRNA MALAT1未甲基化的发夹相比，以 "m6A switch"调控的方式与m6A修饰的发夹结合，这表明m6A修饰破坏了lncRNA的发夹-茎结构，从而促进其与HNRNPC的结合。LncRNA XIST 被METTL3甲基化，在体外和体内实验中METTL3基因敲除均可损害XIST介导的X染色体上基因的转录沉默。细胞质lncRNA linc1281在其3′端区域被甲基化，甲基化标记是通过未知蛋白相互作用与let-7结合所必需的。关于METTL16介导的snRNA沉积，初步研究表明U6 snRNA的A43位置甲基化，该位置位于pre-mRNA 5 '剪接位点碱基对附近区域，表明METTL16在mRNA剪接中起着重要作用。有趣的是，ncRNA在调节m6A的甲基化水平方面也起着重要作用。例如，在分化的干细胞中，miRNAs会通过序列配对机制，调节METTL3与mRNA的结合，从而调节m6A的丰度。同样在肝癌中，抑制miR-145会导致YTHDF2表达增加，进而导致m6A水平下降，这可能是由于mRNA降解增加所致。虽然目前对m6A沉积的功能还不完全了解，但研究逐渐表明m6A甲基化参与了mRNA加工、衰变、稳定性、剪接、多腺苷酸化、核输出和翻译等调控机制。在ncRNA中，m6A也被证明能促进其加工或增强其功能。
三、m6A起着关键作用
m6A在癌症中的作用许多研究表明，m6A在RNA中的沉积在许多生理过程中起着关键作用，包括昼夜节律调节、精子发生、胚胎发生、DNA损伤和应激反应、多能性和细胞重编程。此外，新出现的证据表明，m6A调节因子还与恶性肿瘤的增殖、肿瘤发生、侵袭、转移或免疫系统逃避等致癌或抑瘤功能密切相关。下面，我们总结了m6A中编码器(Writer)、消码器(Eraser)和读码器(Reader)在癌症中的主要新角色（表1）。
i)m6A Writer在癌症中的作用。据报道，METTL3和METTL14的表达可促进多种癌症类型的肿瘤发生。例如，METTL3在急性髓性白血病（AML）中过度表达，被证明可以甲基化BCL-2、PTEN和c-Myc mRNA，导致其翻译增加，抑制细胞分化和凋亡，促进白血病进展。然而，m6A依赖的翻译机制仍未确定。此外，另一项研究发现，METTL3在体内的表达对于维持AML细胞处于未分化状态，从而维持骨髓性白血病的生长至关重要。相比之下，METTL14在AML中通过增加MYB和c-Myc mRNA的稳定性和翻译来作为抑癌基因。METTL3作为癌基因，通过促进EGFR和TAZ的翻译，促进肺癌和结肠癌中细胞的生长、存活和侵袭。METTL3在乳腺癌中也被上调，它能增加HBXIP mRNA的甲基化和稳定性，通过抑制肿瘤抑制因子let-7 g诱导细胞增殖和肿瘤细胞的存活。最近的研究表明，在结直肠癌中也观察到m6A修饰物的异常过度表达，m6A的异常沉积增加了miRNA-1246的表达，导致肿瘤抑制因子SPRED2的下调和转移。最近的其他研究报道，METTL3在前列腺癌细胞中过度表达，通过SHH-GLI1信号传导，促进癌细胞的生长和侵袭。此外，METTL3还能调节ITGB1的表达，从而影响其与Collagen I的结合、肿瘤细胞的移动性，促进前列腺癌骨转移。
尽管METTL3和METTL14在所有这些癌症类型中具有一致的致瘤功能，但在胶质母细胞瘤和肝癌中，一些报告显示两者都具有致瘤和抑制肿瘤的两种作用。最初的研究表明，m6A甲基化通过降低ADAM19等关键致癌转录物的稳定性和表达，抑制胶质母细胞瘤干细胞的生长、自我更新和肿瘤发生，而也有研究发现METTL3可以增加SOX2 mRNA的稳定性和表达，促进胶质母细胞瘤干细胞的生长，并延长小鼠的生存期。同样，在肝癌中，m6A Writer的表达可以反过来促进或抑制肿瘤的发生。例如，METTL14最初被确定为肝癌中的肿瘤抑制因子，METTL14的表达会诱导pri-miR-126的表达增加，抑制肿瘤转移。相反，在另一项研究中发现METTL3上调，与肝癌患者预后不良有关。在另一项研究中，METTL3通过m6A-YTHDF2依赖的方式抑制SOCS2 mRNA的表达。从报道的数据可以得出结论， m6A Writer及其结合因子、Eraser和Reader的不同表达可能是导致m6A沉积水平差异以及靶向RNA差异的原因，而这又将导致观察到的差异和争议。因此，还需要更多的研究来准确确定在胶质母细胞瘤和肝癌中METTL3和METTL14的性质，并识别导致这一争议性发现的因素、途径或肿瘤细胞状态。在其他肿瘤中，METTL3和METTL14起着抑制肿瘤的作用。例如，在子宫内膜癌中，70%的肿瘤通过METTL14突变或METTL3表达下调表现出m6A水平的降低。METTL3-METTL14复合物缺失通过上调AKT通路成员的表达导致细胞增殖增加，从而在子宫内膜癌中表现出肿瘤抑制功能。同样，在肾细胞癌中，METTL3的缺失通过激活PI3K-AKT-mTOR通路促进细胞增殖、生长和集落形成，并通过上皮间充质转化(EMT)通路增强细胞迁移和侵袭。
METTL16在癌症中的意义还不明确，只有少数研究将METTL16与癌症联系起来。最近的研究，在结肠癌中发现了功能缺失突变和表达改变，这表明METTL16在结直肠癌的肿瘤发生中具有一定的作用。另有研究将METTL16与MALAT1 mRNA的成熟相关联，MALAT1 mRNA在不同类型的癌症中可作为癌基因和肿瘤抑制因子。此外，考虑到METTL16在调控snRNA甲基化，进而调控其加工过程中的作用，METTL16的失调可能通过诱导替代性剪接的变化而有利于肿瘤的发展。
ii)m6A Eraser在癌症中的作用已发现m6A Eraser的失调也与癌症风险相关，FTO多态性已被认为与包括癌症风险增加在内的多种人类疾病相关。在发现FTO催化活性后，我们开始了解FTO致癌活性的分子机制。初步研究表明，FTO在AML中高表达，并通过降低肿瘤抑制因子RARA和ASB2的mRNA中的m6A水平，导致其表达受到抑制，从而发挥其致癌功能。同样，FTO通过调节ADAM19，诱导GSCs生长、自我更新、肿瘤进展，并与不良生存期相关。最近的研究将FTO的表达增加与其他肿瘤联系起来。例如在黑色素瘤中，FTO的表达通过直接去除PDCD1、CXCR4和SOX10 mRNA中的m6A，从而增加它们的稳定性，促进肿瘤的发生和对免疫治疗（抗PD-1）的抵抗。FTO在宫颈癌中也被上调，FTO诱导了对化疗放疗的抵抗，并增强了对DNA损伤的反应。此外,FTO可以激活β-catenin通路，增加ERCC1的表达，而ERCC1的表达与宫颈癌预后恶化有关。此外，FTO通过对E2F1和MYC的正向调控促进细胞迁移和增殖。在肺癌中发现FTO过量表达，并与较差的预后有关，通过调节MZF1的表达促进细胞增殖和侵袭，抑制细胞凋亡。在乳腺癌中，高水平的FTO也通过下调BNIP3的表达，在体外和体内促进细胞增殖、菌落形成和转移。令人信服的证据清楚地表明了FTO在癌症中的作用，然而虽然已经描述了FTO可以去除肿瘤抑制因子或基因mRNA中的m6A，从而赋予免疫治疗的抗性，但目前还没有足够的证据证实在癌症中检测到的作用完全是由于其去甲基化酶的活性。
第二种被发现的m6A脱甲基酶ALKBH5的异常过表达也与多种癌症类型有关。在胶质母细胞瘤中发现ALKBH5过度表达，其表达与较差的预后有关，它通过增强FOXM1的表达促进GSCs增殖和肿瘤进展。在乳腺癌中，ALKBH5通过降低KLF4和NANOG mRNA的腺苷甲基化，增强其在乳腺癌干细胞中的稳定性，促进肿瘤的发生。在胃癌中，它通过去甲基化lncRNA NEAT1促进侵袭和转移。在卵巢癌中也发现ALKBH5表达增加，其表达与生存率较差相关，其表达上调通过mTOR和BLC2-Beclin1途径促进增殖、侵袭和自噬。与其他m6A调节剂类似，ALKBH5在其他肿瘤中也被证明具有抑制肿瘤的作用。例如，在胰腺癌细胞中，ALKBH5的丢失会诱导lncRNA KCNK15-AS1的甲基化增加，导致其下调和细胞迁移增加。胰腺癌中的ALKBH5也被证明可以通过降低WAF-1水平和阻碍Wnt信号激活来抑制肿瘤的发生。
iii)m6A Reader在癌症中的作用m6A Reader在癌症中也异常表达，其功能缺陷与致癌或抑瘤作用有关，然而我们现在才开始了解这些RNA结合蛋白、m6A和癌症的相互作用。YTHDC2和YTHDF1在结直肠癌中过度表达，两者都与患者的不良预后和高细胞增殖及转移潜力有关，其中YTHDC2调节HIF1A等肿瘤启动子基因的表达，沉默YTHDF1可通过抑制Wnt-β-catenin通路，抑制体外肿瘤的发生性和体内肿瘤的生长，其表达可诱导对化疗的抵抗。YTHDF1在癌症中也被上调，特别是在卵巢癌中，YTHDF1可增加EIF3C的翻译，促进肿瘤的发生和转移。而在黑色素瘤中，YTHDF1则作为一种肿瘤抑制因子，它能促进肿瘤抑制因子HINT2的翻译，从而抑制肿瘤的发展。YTHDF2在AML中的过度表达被证明可以降低各种含m6A的转录物的半衰期，这些转录物参与TNF信号传导，其上调可以促进细胞凋亡。此外，YTHDF2被发现在肺癌中上调，并异常地促进6PGD mRNA的翻译，而6PGD mRNA是促进肿瘤生长的关键。然而，YTHDF2也能够通过促进HCC细胞中EGFR mRNA的降解来抑制细胞增殖、肿瘤生长以及MEK和ERK信号的激活。
四、m6A调控的致癌信号通路
癌变过程涉及到关键信号分子的异常表达，这些分子受编码基因的严格调控。鉴于m6A修饰在基因表达调控中的作用，m6A很可能通过上调或下调细胞信号的重要成分来促进癌变，本综述汇编了在不同癌症中由于m6A修饰而异常表达/激活/灭活的关键信号通路中的关键信号分子以及作用于它们的调控因子。
m6A在各种信号通路中调控的分子靶点
1.Wnt/β-catenin信号通路
Wnt/β-catenin通路在发育过程和维持成人组织稳态中起着重要作用。该信号通路的关键成分是驻留在效应细胞表面或从效应细胞释放的糖蛋白Wnt。参与该信号通路的蛋白分子还有Frizzled、LRP5/6、Dishevelled、GSK-3、 CKI、Axin、APC、β-catenin等。研究发现，在不同癌症中存在m6A修饰，并可能影响Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白表达。
①METTL3被发现在肝母细胞瘤(HB)中高表达，并与晚期临床特征如血管侵犯、远处转移或HB复发有关。在分子水平上，miR-186直接靶向METTL3，通过直接结合METTL3 mRNA的3 -UTR来降低其表达。HB肿瘤中miR-186的表达明显下调，导致METTL3蛋白高表达。miR-186/METTL3轴还被发现调节Wnt/β-catenin信号通路，促进HB细胞增殖、迁移和侵袭。METTL3高表达和miR-186低表达时，Wnt/β-catenin通路相关蛋白如β-catenin、APC、cyclin D1和c-myc也过表达。
②在HB中，METTL3通过增加CTNNB1 (β-catenin)、CCND1 (cyclin D1)、NKD1 (Wnt信号抑制剂)等通路中重要基因的m6A水平来调节HB中的Wnt/β-catenin通路。METTL3和编码β-catenin的CTNNB1基因之间存在显著的正相关，通过降低CTNNB1转录本m6A甲基化水平，下调了CTNNB1的表达和稳定性，表明CTNNB1是HB细胞中METTL3的直接下游靶点。
③m6A甲基化被报道在PARP抑制剂(PARPi)耐药的BRCA突变卵巢上皮性癌(EOC)中发挥致癌作用。研究发现，Wnt/β-catenin信号通路分子FZD10由于其3’UTR区域m6A甲基化增加而上调。在这些细胞中，METTL3和METTL14水平虽没有明显升高，但去甲基化酶FTO和ALKBH5水平的下降足以增加FZD10 mRNA中的m6A水平。此外，IGF2BP2表达水平上调，同样增加了FZD10 m6A甲基化水平，从而增加细胞核中的β-catenin水平，进一步上调其靶基因FOSL1和CCND1。
④在人骨肉瘤(OS)中，METTL3和m6A甲基化水平上调会激活Wnt/β-catenin信号。淋巴增强因子结合因子1 (LEF1)是METTL3的靶点。随着METTL3的上调，LEF1 mRNA的m6A甲基化增加，也增加了其稳定性，导致Wnt/β-catenin通路激活。
⑤低ALKBH5表达与Wnt/β-catenin通路激活导致的胰腺腺癌进展和化疗耐药性增加相关。ALKBH5过表达通过m6A去甲基化介导Wnt抑制因子-1 (WIF-1)的上调来阻断该通路，而在胰腺癌中，ALKBH5下调可以克服Wnt抑制因子-1的上调。
⑥YTHDF1过表达激活Wnt/β-catenin通路，与结直肠癌(CRC)进展呈正相关。在CRC细胞中，YTHDF1能够识别FZD9和WNT6的m6A甲基化修饰，并增强其翻译。异常增加的FZD9和WNT6蛋白激活Wnt/β-catenin通路，从而增强肿瘤致瘤性和CRC干细胞形成。
⑦YTHDF1过表达也通过m6A介导的FZD7 mRNA翻译和Wnt/β-catenin过活化与胃癌进展相关。
2. PI3K-Akt-mTOR信号通路
PI3K-Akt-mTOR通路在细胞生长、营养摄取、合成代谢以及在某些病理条件下，特别是癌症中具有非常重要的作用。PI3K-AKT-mTOR信号通路最主要的4个靶点是PI3K、AKT、mTOR、PTEN。据报道，在不同类型的癌症中，PI3K-Akt-mTOR通路成分的表达改变与m6A mRNA甲基化或其调控因子的改变有关。
①在人子宫内膜癌中存在发生METTL14热点R298P突变和METTL3下调，导致Akt-mTOR通路中PHLPP2和mTORC2 m6A甲基化程度降低，PHLPP2甲基化程度的降低降低了其表达，而mTORC2复合物(PRR5、PRR5L和mTOR)甲基化程度的降低增加了其稳定性和表达，可能促进子宫内膜癌细胞的增殖和致瘤性。
②METTL3减少和FTO增加导致的m6A甲基化程度降低也与胃癌(GC)的肿瘤发生增加有关。METTL3敲低后，Akt和S6磷酸化激活了PI3K-Akt通路。METTL3的下调也激活了Wnt/β-catenin通路，FTO下调则相反。这些结果表明，m6A甲基化程度降低是促进胃癌细胞增殖和侵袭性增加的原因。
③在卵巢癌中，METTL3通过调控m6A修饰介导miR-126-5p成熟和上调，miR-126-5p抑制PTEN表达，导致PI3K/Akt/mTOR通路激活，从而促进卵巢癌进展。
④胃肠道癌(结肠直肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌)中，抑制METTL3- METTL14复合物的甲基转移酶活性增加了PTEN、Akt1、PIK3CA和mTOR的稳定性和表达。相反，抑制FTO的去甲基化酶活性则降低了PTEN、Akt1、PIK3CA和mTOR的稳定性和表达。
⑤在鼻咽癌中，YTHDC2通过增加胰岛素样生长因子-1受体(IGF1R) mRNA的翻译来激活PI3K-Akt/S6信号通路，导致癌细胞耐药。与放疗敏感的鼻咽癌细胞相比，放疗耐药的鼻咽癌细胞中YTHDC2表达上调。
⑥METTL3的表达与肾细胞癌进展呈负相关。METTL3通过降低p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p-P70等蛋白磷酸化水平抑制PI3K-AKT-mTOR通路。
⑦hnRNPA2B1在宫颈癌中表达上调，激活PI3K-Akt通路，促进癌细胞增殖、侵袭和迁移。
⑧在子宫内膜癌中，雌激素可通过激活PI3K-Akt和MAPK通路诱导m6A去甲基化酶FTO的表达，而FTO是PI3K-Akt和MAPK的下游靶点。FTO还激活了乳腺癌细胞中的PI3K-Akt通路，促进糖酵解和乳酸的产生。尽管在这些研究中未检测到PI3K-Akt通路分子m6A甲基化变化，但FTO或hnRNPA2B1可能通过改变或识别其甲基化状态，参与调控其靶基因的表达。
3. JAK-STAT信号通路
JAK-STAT信号通路是众多细胞因子信号转导的共同途径，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡以及炎症等过程。JAK-STAT通路的活性受到三种不同类别蛋白质的负调控：细胞因子信号转导抑制蛋白 (SOCS)、活化STATs蛋白抑制因子(PIAS)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)。研究发现，m6A可能在转录水平调控该通路主要成分的表达，进而导致癌症进展中的异常信号。
①与正常肝细胞相比，METTL3在癌细胞中表达上调。体外细胞实验证实敲除METTL3后能够降低细胞增殖和转移能力以及裸鼠的致瘤性。SOCS2作为METTL3修饰的靶点，该靶点被YTHDF2识别并导致其降解。由于m6A甲基化水平提升，SOCS2更容易被YTHDF2降解，最终导致肝癌恶化。相反，由于METTL3敲低导致的SOCS2过表达增加了磷酸化STAT5的表达，表明m6A在HCC进展中对JAK-STAT通路具有调节作用。
②结直肠癌中METTL3水平升高，m6A甲基化降低了SOCS2稳定性，SOCS2水平随之下调，从而消除了其对LGR5表达的抑制作用。LGR5与结肠癌细胞的干细胞性和化疗耐药性有关。因此，SOCS2通过LGR5诱导CRC中癌细胞的增殖。
③METTL3水平升高和SOCS2蛋白水平降低也增加了胃癌细胞的增殖，但本研究中没有涉及STAT活性的改变。
4. MAPK信号通路
有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)是一族在真核生物中非常保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，在许多细胞活动中起作用，如生长增殖，细胞分化，细胞运动或死亡。
MAPK通路有4种主要的分支路线：ERK、JNK、p38/MAPK和ERK5，Ras、Raf、MEK和ERK蛋白是该通路中的关键因子，其中任何一个蛋白的功能异常都会导致严重的肿瘤疾病。MAPK信号失调与许多癌症类型有关。然而，m6A甲基化修饰在癌症中调节这一途径的作用直到最近才开始显现。
①在肾细胞癌中，METTL14下调降低了P2RX6 mRNA中的m6A水平，从而增加了其表达，使Ca2+内流，进而激活ERK1/2 MAPK通路，促进RCC细胞迁移和侵袭
②研究发现，METTL3的降低与结直肠癌肿瘤大小、进展和转移相关，其中，METTL3下调激活了MAPK通路相关蛋白，特别是p38和ERK，导致CRC细胞增殖、迁移和侵袭性。METTL3在结直肠癌中的相反作用也有报道。METTL3增加了pri-miR-1246中的m6A修饰，促进其成熟，从而抑制其下游靶点SPRED2的转录，SPRED2激活Raf/MEK/ERK通路。抑制SPRED2可抑制Raf/MEK/ERK蛋白的磷酸化，消除其对癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。
③METTL3过表达通过m6A介导BATF2的下调促进了胃癌的进展。BATF2是一种肿瘤抑制因子，通过增强p53蛋白的稳定性从而抑制ERK信号。METTL3介导的BATF2下调逆转了这一效应。
④与正常组织相比，CRC患者癌组织中YTHDC2表达较低。YTHDC2激活p38 MAPK，促进多个基因的转录，引起外源性死亡受体通路相关蛋白caspase8、Fas和FasL以及内源性线粒体凋亡通路蛋白Bax、caspase 9和细胞色素C的上调。
⑤WTAP在高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)中高表达。在卵巢癌细胞中下调WTAP后， MAPK相关蛋白如p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p38和p-p38以及AKT通路蛋白(p-AKT, AKT)的表达降低，表明这两种通路与卵巢癌中的WTAP有关。
⑥在肝细胞癌中，YTHDF2通过直接靶向MAPK通路上游调控因子EGFR，以促进肝癌细胞中EGFR mRNA的降解，从而发挥抑制MAPK通路的作用。
5. p53信号通路
P53是一种著名的肿瘤抑制因子，也被称为基因组的守护者。在正常细胞基础状态下，Mdm2、COP1、ARF-BP1、Pirh2等几个负调控因子将p53水平维持在一个稳定的状态水平。据报道，m6A甲基化修饰复合物成分改变可能会引起mRNA转录本中m6A状态的改变，进而影响各种癌症类型中p53信号通路相关基因的表达。
①在肾透明细胞癌患者中，m6A调控基因拷贝数的变化和TP53状态的改变，与疾病预后差和总生存率相关。在这些患者中，METTL3和METTL14表达水平高于正常对照，被认为与TP53改变显著相关。
②在食管癌中，某些m6A调控蛋白表达水平上调。其中HNRNPC高表达表型与细胞周期和p53信号通路的激活有关。
③在胰腺癌患者中，ALKBH5的过度表达可降低了体外肿瘤的增殖、迁移和侵袭活性，改善了体内肿瘤生长，而ALKBH5基因敲除可促进胰腺癌的进展。ALKBH5调控m6A去甲基化，减少YTHDF2识别m6A导致的mRNA降解，从而在转录后水平上激活PER1，PER1上调导致ATM-CHK2-P53/CDC25C信号的激活，抑制细胞生长。而P53诱导的ALKBH5转录激活又是对m6A修饰的反馈调节。胰腺癌中m6A甲基化中断了ALKBH5-PER1-p53-ALKBH5反馈环路，从而促进了肿瘤的生长和侵袭性。
④METTL3过表达介导的m6A修饰增加，促进了p53突变和结肠癌细胞化疗耐药性的增加。由于糖酰神经酰胺合成酶(GCS)的增加，癌细胞膜糖鞘脂质富集微域(GEMs)中糖鞘脂质(特别是Gb3)的升高激活了cSrc/β-catenin信号通路，从而上调了METTL3的表达。METTL3过表达增加了p53 pre-mRNA中273点突变密码子的m6A修饰，优先剪接突变蛋白的表达。抑制糖鞘脂Gb3的产生或沉默METTL3可以抑制p53 pre-mRNA中的m6A修饰，激活p53通路，从而使细胞对化疗药物重新敏感
⑤FTO在人非小细胞肺癌细胞中表达上调，促进肿瘤细胞增值。FTO通过降低泛素特异性蛋白酶-7 (USP7) mRNA中的m6A水平，而稳定和增加USP7蛋白的表达。USP7蛋白在p53通路依赖的肿瘤进展中发挥重要作用，抑制USP7可促进e3 -泛素连接酶Mdm2的降解，进一步抑制p53的泛素化和降解，从而抑制肿瘤发展。FTO稳定了USP7转录本，使其上调，最终因抑制p53通路而促进NSCLC细胞的生长。
⑥在肝细胞癌中，METTL3已被证明通过降低RDM1的水平发挥致瘤作用。RDM1是DNA双链断裂修复和重组、RNA加工和蛋白质翻译的关键调控因子。研究发现，RDM1与p53蛋白结合可延长其半衰期，并可调节下游蛋白p21、Cyclin A1和14 3-3σ，从而发挥抑癌作用。在野生型p53存在时，RDM1也可以抑制Ras/Raf/ERK信号通路。METTL3诱导了RDM1 m6A甲基化修饰，从而降低了RDM1转录本的稳定性，并抑制了RDM1蛋白的表达。
6. Hippo信号通路
Hippo信号通路是控制器官发育或维持组织稳态的关键途径之一。在哺乳动物中，Hippo信号通路上游的膜蛋白受体感受到胞外环境的生长抑制信号后，经过一系列激酶的磷酸化反应，最终作用于下游效应因子YAP和TAZ。研究报道，在人类肿瘤中，Hippo通路YAP和TAZ表达的主要决定因素受m6A修饰的调节。
①在人非小细胞肺癌中，METTL3诱导的m6A mRNA甲基化通过招募YTHDF1/3和eIF3b到翻译起始复合物中促进YAP mRNA的翻译，并通过调节MALAT1-miR-1914-3p-YAP轴增加YAP mRNA的稳定性，从而促进肿瘤的生长、转移和对NSCLC细胞的耐药性。此外，还有研究发现，m6A去甲基化酶ALKBH5通过降低YTHDFs介导的YAP表达和抑制miR-107/LATS2介导的YAP活性来抑制NSCLC的生长和转移。
②在肺腺癌中，METTL3表达升高也会增加癌蛋白EGFR和Hippo通路效应蛋白TAZ的翻译，从而增加肿瘤细胞的生长、存活和侵袭性。研究发现，METTL3通过直接募集eIF3增强目标mRNA的翻译。
③在结直肠癌中，METTL14 通过 miR-375/Yes相关蛋白 1 （YAP1） 通路抑制 CRC 细胞生长，并通过 miR-375/SP1 通路抑制 CRC 细胞迁移和入侵。
METTL14水平降低，导致pri-miR-375中m6A甲基化降低，从而抑制DGCR8对miR-375的成熟。miR-375下调导致致癌基因YAP1和SP1的上调，促进肿瘤进展。
④YTHDF2在胰腺癌中表达上调，通过激活Akt/GSK3β/Cyclin D1通路促进癌细胞增殖。然而，YTHDF2过表达也抑制了胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力，这种效应被称为“migration-proliferation dichotomy”(迁移-增殖二分法)。YTHDF2通过上调和磷酸化Mob1来抑制EMT，Mob1反过来磷酸化并激活LATS1和pLATS1，进一步磷酸化并灭活YAP。
7. 其他信号通路
除上述途径外，其他几个细胞信号途径如NFκB、Hedgehog、Notch、Snail信号途径等也会被m6A甲基化或其调控蛋白直接或间接修饰，导致细胞恶性转化和癌症发展。
①IL-6联合lncRNA CUDR通过METTL3激活NFκB信号，诱导人胚胎干细胞来源的肝细胞样干细胞恶性转化。在炎症因子IL-6的触发下，lncRNA CUDR的过表达增强了METTL3的表达以及SUV39H1的表达。SUV39H1反过来增强Histone3的单甲基化、二甲基化和三甲基化，导致NFκB的表达和磷酸化。活化的p-NFκB易位到细胞核，促进STAT3的表达和磷酸化。p-STAT3通过与靶miRNAs和lncRNAs的启动子区相互作用，导致肝细胞样干细胞的恶性转化。
②肿瘤微环境中释放的细胞因子通过改变细胞m6A状态与NFκB激活和肿瘤进展相关。在与巨噬细胞共培养的卵巢癌细胞中，ALKBH5和TLR4的表达增加。
与正常卵巢组织相比，ALKBH5在卵巢癌组织中也有上调。结果发现，ALKBH5水平升高是TLR4介导的NFκB通路激活所致。ALKBH5通过增强m6A甲基化程度进一步靶向NANOG转录本，从而促进卵巢癌干细胞的生成和癌变。
③METTL3和m6a增加介导的雌激素受体相关受体γ (ERRγ)的上调被证明可以触发癌细胞的化疗耐药。ERRγ与NFκB/p65相互作用，诱导ABC转运体ABCB1的转录激活(从而增加P-gp的表达)，从而促进药物外排。
④METTL3在膀胱癌中表达上调，促进增殖、迁移和抑制癌细胞凋亡死亡。METTL3的这种致癌作用是通过对MYC致癌基因的多水平调控来介导的，其中之一就是激活NFκB通路。
⑤METTL3还对Hedgehog通路发挥调控作用，促进前列腺癌细胞增殖、存活和侵袭能力。METTL3通过提高GLI1的表达来发挥这些作用，GLI1是Hedgehog信号蛋白的关键之一，通过上调下游靶点c-Myc和cyclin D1来促进前列腺癌的进展。
⑥在胶质瘤干细胞样细胞中发现METTL3上调，通过激活Notch信号促进肿瘤发生。一些Notch信号基因(如Notch配体DLL1、DLL3和JAG2, Notch受体NOTCH1、NOTCH2和NOTCH3，以及Notch靶点HES1) m6A甲基化修饰增强，从而导致其上调。
⑦METTL3上调通过Snail通路促进肝癌细胞的迁移和侵袭。METTL3增加了Snail编码序列(CDS)中的m6A水平，从而被YTHDF1识别，触发多聚核糖体介导的Snail mRNA翻译。
⑧在肝癌细胞中，METTL3被小分子泛素样修饰物SUMO1修饰，该修饰物在有丝分裂原刺激下增加其表达。上调METTL3进一步调节Snail mRNA稳态，促进肝癌进展。
五、m6A靶向癌症治疗的前景
近年来，随着研究的不断深入，m6A修饰及其调控因子在癌症发生发展中的作用越来越明显，但这种RNA修饰是否能够靶向用于癌症治疗还有待解决。目前为止，关于此方面的研究主要是基于m6A修饰酶的靶向。这些酶具有高分辨率的晶体结构，有助于预测潜在的结合位点，这些位点可用于设计具有高亲和力的分子。虽然在理解m6A修饰在多种致癌信号通路中的重要作用方面已经取得了重大进展，但仍需进一步研究加强m6A修饰失调与癌症之间的联系，从而将m6A调节因子作为有效的癌症治疗靶点。
若进一步探究m6A修饰是否能够靶向用于癌症治疗，我们还需要考虑：
第一，m6A修饰可能在癌症中发挥双重作用，在某些情况下具有致癌作用，而在其他情况下具有抑瘤作用。
第二，目前关于m6A修饰在癌症中作用的研究多在癌细胞中进行，对于m6A修饰失调是否在正常细胞转化为癌细胞的过程中发挥作用仍未知。m6A修饰失调是否以及如何参与各种癌症病因因素引起的细胞恶性转化还需要进一步的研究。
第三，目前已知m6A修饰存在于不同类型的细胞RNA(如mRNA、lncRNA、miRNA等)中。然而，关于m6A调控致癌信号通路的研究主要集中在mRNA上，需要进一步研究确定m6A失调在非编码RNA，特别是lncRNA中调控肿瘤起始和进展的致癌信号通路中的作用。
第四，m6A修饰同时影响多个通路中的信号分子，很可能单个m6A调控因子的表达改变可能在多个致癌通路的失调中发挥关键作用。因此，针对单一m6A调控分子可能导致多种致癌信号通路的抑制。需要进一步的研究来确定是否单独靶向m6A调控分子或与其他目前批准的抗癌药物联合是有效的癌症治疗策略。
靶向m6A调控因子开发新型癌症疗法的前景
后来 ▏ m6A常见纯生信思路
经过上面的介绍，我们可以得到m6A参与的过程很多，m6A调节因子这一块本身就存在很大的研究空间，同时m6A还参与了很多相关的过程，比如肿瘤预后，肿瘤治疗等，它还参与了很多的通路。基于此m6A的研究也是针对如上的综述一条条展开来给大家分析。
A、m6A调节因子本身
m6A Signature and Tumour Immune Microenvironment for Predicting Prognostic Value in Gliomas
m 6 A signature与肿瘤免疫微环境对胶质瘤预后的预测价值
首先作者对TCGA-GBM / LGG数据集中的m 6 A RNA甲基化调控子进行了共识聚类。通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）分析了癌症基因组图谱（TCGA）胶质瘤队列的肿瘤浸润免疫细胞。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）和最小绝对收缩和选择算子（LASSO）鉴定了四个hub基因。通过风险评分分析，Kaplan-Meier和ROC验证了诊断和预后价值。
B、m6A和通路
胃肠癌PI3K/Akt/mTOR信号通路中m6A RNA修饰调节的研究
腺苷(m6A) N6位点的甲基化是哺乳动物蛋白编码mRNA中最常见的RNA修饰，是一种具有多种重要生物学功能的可逆修饰。m6A在胃肠道(GI)癌中的潜在修饰机制尚不清楚。本文对胃肠道中已知的9种m6A writer、erasers和reader蛋白进行了全面的分子层面分析。
首先用cBioportal进行基因改变及通路分析。STRING分析m6A调控因子及其相关通路蛋白网络，MEGA7构建系统发生树，SRAMP预测m6A修饰位点。m6ASNP分析m6A相关SNP。此外实验部分使用m6A-seq、real-time PCR和phospho - mapk阵列验证m6A在其通路的调控，文章用的数据全部来自于公开数据库。
C、m6A与疾病
m6A regulator-mediated RNA methylation modification patterns are involved in immune microenvironment regulation of periodontitis
m6A调控子介导的RNA甲基化修饰模式参与了牙周炎免疫微环境调控
牙周炎是在牙周支持组织中发生的一种慢性炎症，是由对牙菌斑中细菌的炎症反应引起的。此外，牙周炎已被证明是其他全身性疾病的潜在致病因素，例如糖尿病，心血管疾病和类风湿性关节炎。最近的研究表明，m6A调控可以解释免疫调节的一些潜在机制。在这项研究中，作者系统地评估m6A调控子在牙周炎中的修饰模式。研究发现，m6A调控子可以很好地区分健康样本和牙周炎样本，并且识别了具有不同免疫特性的m6A修饰模式。
D、M6A相关的lncRNA
m6A-related lncRNAs are potential biomarkers for predicting prognoses and immune responses in patients with LUAD
利用TCGA中lncRNAs和m6A基因的表达谱，以及LUAD(肺腺癌)患者数据，识别出了m6A相关的lncRNAs作为LUAD预后和免疫反应的潜在标志物(图4)。
作者首先用Pearson相关分析筛选出了与21个m6A基因相关的lncRNAs；然后，LUAD数据集被随机分为训练集和验证集，结合临床信息，通过单变量Cox回归分析进一步筛选与OS相关的lncRNAs，又利用LASSO Cox回归分析识别出24个与OS显著相关的m6A-related lncRNAs；接下来，采用多因素Cox回归分析建立了一个基于12-m6A-related lncRNAs的风险模型，并根据中位数风险得分为低风险组和高风险组，Kaplan-Meier用来分析两组之间的OS差异。此外，还利用药物敏感性数据发现了靶向这些lncRNAs的候选药物。
E、m6A与免疫浸润
RNA m6A methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming
于3月份发表自Nature Communications(IF:12.121)，主要研究RNA m6A甲基化在巨噬细胞中的功能和作用机制。
既然m6A跟免疫细胞是相关的，那么跟免疫细胞对应的免疫基因也是相关的。近期Frointer杂志发表文章m6A调控的免疫相关的基因来构建的分组研究肿瘤的预后。
Identification of m6A Regulator-Associated Methylation Modification Clusters and Immune Profiles in Melanoma
E、m6A与新冠
m6A Regulator-Mediated Methylation Modification Patterns and Characteristics of Immunity in Blood Leukocytes of COVID-19 Patients
文章于2021年9月投稿，2021年12月份发表于Frontiers in Immunology，历时3个月。研究人群为感染新冠病毒的126个患者，目的探讨血液中的白细胞m6A水平与感染新冠病毒后发生的变化，以及对患者预后的影响。下载GEO数据库中芯片数据（GSE157103），我们发现COVID-19患者血白细胞的m6a修饰水平明显高于非COVID-19患者，这种差异与CD4 + T细胞有关。通过无监督聚类鉴定出两个聚类，以T细胞活化为特征的m6a聚类A比m6a聚类b预后更高。代谢水平升高，免疫检查点阻塞，m6A簇b中m6A评分较低，根据9个筛选出的基因构建保护性模型，对COVID-19具有良好的预测价值。进一步分析发现，保护评分与HFD45、无呼吸机天数呈正相关，与SOFA评分、APACHE-II评分、crp呈负相关。我们的研究系统地描述了SARS-CoV-2感染患者中m6a甲基化修饰与宿主淋巴细胞之间的复杂相关性，并为预测患者的预后提供了一个良好的模型。
F、m6A与泛癌
1、m6A本身
Molecular characterization and clinical relevance of m6A regulators across 33 cancer types
33种癌症类型的m6A调节因子的分子表征和临床意义
这项研究旨在系统地表征33种癌症类型中m6A RNA调节因子的分子变化和临床相关性以及评估m6A调节因子表达的扰动是否与癌症通路的活性相关。研究发现跨癌症类型的m6A调节因子存在广泛的遗传改变。此外通过探讨m6A调节因子的临床预后价值，发现m6A调节因子可能是预后分层的有效标志。该分析突出了m6A调节因子在癌症发展中的重要性，并为基于RNA甲基化的治疗策略的发展奠定了基础。
2、m6A相关的lncRNA
Pan-cancer characterization of expression and clinical relevance of m6 A-related tissue-elevated long non-coding RNAs
m6A相关组织提高长非编码RNA的泛癌表达特征及临床意义
m6A是癌症研究的热点，而今天小编要和大家分享的是今年一月份发表在Molecular Cancer（IF:15.302）杂志上的关于泛癌中m6 A相关长非编码RNA的文章。
m6A作为一种关键的内部RNA修饰，在癌症的发生发展中发挥着重要作用。同时，研究已经发现m6A存在于多种非编码RNA中，如microRNAs和长非编码RNA (lncRNAs)。其中lncRNA包含了大量的RNA转录本，是基因表达的关键调控因子，而且lncRNA的调控效果与空间表达密切相关，其调控异常往往影响癌症的发展和进展。基于这些原因，对lncRNA在组织或癌症中的空间表达进行全局刻画，可以提高对lncRNA功能的理解。然而，目前对m6A修饰在lncRNA中的分布和功能，特别是在组织升高(tissue-elevated, TE) lncRNA中的作用仍缺乏了解。因此，在这篇研究中，作者系统地刻画了m6A相关TE lncRNA在组织和癌症类型中的分布和临床意义。
3、M6A相关的micRNA
m6A target microRNAs in serum for cancer detection
血清中的m6A靶向microRNA 用于癌症检测
一篇关于m6A靶向miRNA 在泛癌中的诊断和预测价值的文章，文章发表在《Molecular Cancer》（IF: 27.401）上。
数据组成：这项研究中所用到的数据来自于GEO数据库（GSE164174、GSE113740、GSE137140、GSE139031、GSE122497、GSE112264、 GSE113486、 GSE106817、 GSE124158、 GSE73220），包含12中癌症和正常个体的14965份血清样本，分别是胃癌（GC，n = 1417）、肝细胞癌（HCC，n = 388）、肺癌（LC，n = 1573）、胶质瘤（n = 185）、食管癌（ESCA，n = 566）、前列腺癌（PRAD，n = 809）、膀胱癌（BLCA，n = 392）、卵巢癌（OV，n = 338）、SARC=肉瘤486）、乳腺癌（BRCA，n = 1285）、结直肠癌（CRC，n = 242）和胰腺癌（PAAD，n = 197）以及正常对照（n = 7087）。
研究思路：
本文的研究思路大致可以分为三部分（参见图1A流程图）：
鉴定m6A靶向miRNA、构建回归模型和m6A-miRNAs诊断模型的评估与验证。
经过文章的整体梳理，包括m6A相关背景的介绍和思路介绍，相信各位小伙伴已经知道如何对m6A下手了，小编相信新的一年关于m6A的各种文章还会有很多，也基本会在如上的方向上，生信人对于新出现的m6A的思路也会及时推送，感谢大家关注生信人。
2022年希望大家多发文章
祝大家新年快乐，万事如意
更多精彩文章解读，尽在生信人公众号
网友评论