2023-03-21

Nat Biotech | CITE-seq技术实现细胞级抗原表位与转录组共定位

原创 骄阳似我 图灵基因 2023-03-21 11:17 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学技术

撰文：骄阳似我

IF：68.164

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亮点：

本文的研究团队利用CITE-seq技术，在细胞分辨率的空间维度下，检测了小鼠不同器官组织中的189个细胞表面蛋白质与对应的转录组信息，同时也对人体组织中的273个表面蛋白质与对应的转录组进行测序分析，实现了高倍蛋白与整个转录组的共定位；同时作者的研究团队也对注射新冠病毒疫苗的局部活检组织皮肤进行测序分析，揭示了在注射疫苗后，局部外周T细胞被激活。

*CITE-seq：CITE-seq全称为“Cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing”，该技术可以在单细胞水平将基因表达信息与细胞表面蛋白信息通过测序的方法联合起来，达到同时检测细胞表面的蛋白质信息与胞内转录组信息的目的。该技术相较于单独的单细胞转录组测序而言，额外地加入了细胞表面蛋白的表达信息，再联合同一细胞内的转录组信息，可以更加深入地区分细胞异质性、更精确地挖掘特异性的细胞类型，探索治疗耐药性等生物学现象背后的机制。

空间转录组测序已经在细胞分化和组织发育的领域得到飞速的发展，但是目前对于较大量的高复合蛋白质，还未纳入研究范围。如果实现了高倍体（>100）蛋白的定位，到底可以同时定位多大的表面蛋白，以及可以获得什么差异，目前还是一片未知，带着这样的疑问，作者的研究团队就此对高倍蛋白与转录组的共定位开展了研究。

近期，耶鲁大学的Rong Fan教授团队在Nature biotechnology杂志上发表了一篇名为“High-plex protein and whole transcriptome co-mapping at cellular resolution with spatial CITE-seq ”的文章，他们利用CITE-seq技术，对小鼠不同器官组织中的189个蛋白及人体组织中的273个表面蛋白开展了表面蛋白和转录组的并行测序分析，实现了高倍蛋白与整个转录组的共定位，并对注射新冠病毒疫苗的局部活检组织进行测序分析，揭示了注射疫苗的局部皮肤内外周T细胞被激活。

空间CITE-seq的工作设计流程

作者首先向我们展示了CITE-seq的工作流程。该方法使用200-300adt的混合物对组织载玻片进行染色，每个ADT包含一个poly (A)尾巴，一个唯一的分子标识符（UMI）和一个相应抗体唯一的特定DNA序列，将其随机组合，并形成固定切片。接下来，使用微流控芯片向组织表面引入一组DNA行条形码A1-A50，该序列与adt或mrna的聚(A)尾部结合，然后进行组织内逆转录；最后，对条形码cdna进行回收、纯化和扩增聚合酶链反应（PCR），制备两个下一代测序（NGS）文库，分别用于adt和mrna的配对测序，用于计算重建空间蛋白或基因表达图（图1a）。

对小鼠不同组织的189个蛋白及转录组进行测序分析

作者检测了在多种小鼠组织类型中的189种蛋白质的空间定位和全基因组表达，包括脾脏、结肠、肠和肾脏。脾脏样本中的空间蛋白谱导致了5个主要的簇，转录组聚类分析确定了7个聚类，它们也与空间高倍蛋白聚类相一致。作者还分析了小鼠的结肠、肠和肾组织，由此确定，产生的主要簇与解剖区域相关（图1b）

对人体扁桃体273个蛋白及转录组进行测序分析

在2.5 mm×2.5 mm的区域，每像素的平均蛋白计数为239，平均UMI计数为4309，仅对空间蛋白图谱进行聚类，就鉴定出7个主要的聚类，相应的空间分布表现出高度明显的特征（图1f）。作者获得的空间转录组产生了8个主要的簇（图1g），它们的空间分布（图1h）与空间蛋白簇有很好的相关性，但噪声更大，精度更低。蛋白表达分析（图1i）可以识别每个聚类中的主要细胞类型。组织图像和空间蛋白簇图的叠加（图1j）显示，解剖特征与组织细胞类型之间有很强的相关性。

进一步可视化蛋白质

B细胞的CD19标记物在卵泡中富集。CD21或补体受体，存在于所有成熟的B细胞和滤泡树突状细胞（DCs）上，在整个卵泡中高表达。CD23先前在成熟的B细胞、活化的巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、滤泡树突状细胞和血小板上发现，它局限于GC光区12的顶端区域。

进一步检测了与B细胞分化和成熟相关的功能蛋白

如免疫球蛋白（图1k）。IgM的表达仅限于GC B细胞。一旦它们进一步成熟，这些B细胞就开始产生IgG并迁移出卵泡。IgD主要由刚刚从血液中流出的幼稚B细胞产生（图1l）。CD90（Thy-1）与多种细胞类型相关，但在GCs中完全缺失。Notch3存在于鳞状上皮细胞中。Mac2/Galectin3在隐窝区高度富集（图1m）。

作者还还检测了T细胞标记物CD3

该标记物识别了所有主要的T细胞区，以及辅助T细胞的CD4和幼稚或干细胞样T细胞的CD45A（图1n），CD9在卵泡和隐窝的扁桃体B细胞中均有表达。CD171是一种与神经突生长、髓鞘形成和神经元分化有关的神经元细胞粘附分子，被发现在暗区高度受限。据我们所知，这在以前没有报道过，值得进一步研究（图1O）图1.空间-cite-seq工作流的设计和应用于不同的小鼠组织类型和人类扁桃体，用于蛋白质和整个转录组的共定位

对接种新冠疫苗的皮肤活检组织进行CITE-seq检测，并绘制免疫激活状态图

组织切片由低细胞密度的胶原丰富区和高细胞密度的血管颗粒区组成（图2a），基因计数的空间图谱与细胞密度相关，高细胞密度区域每像素产生411个基因（图2b）。然而，即使在低细胞密度区域，无监督聚类也能识别出空间上不同的聚类（图2c），在整个组织切片上，蛋白计数的空间图变化较小，在低密度区域可检测到高达~的270个蛋白（图2e）。

空间蛋白谱的聚类得到了10个聚类（图2d），相应的空间分布（图2f）与空间转录组聚类具有高度的差异和很强的一致性。与空间转录组结合进行聚类，得到13个主要聚类，并根据基因肿瘤学确定主要细胞类型（图2g）。细胞类型的标签转移从scRNA-seq到空间组织像素，可以可视化不同类型的分布（图2h）。

进一步可视化单个基因的表达

凋亡相关基因CCNL2和NOL3在血管区域表达；APOC1（负责脂蛋白代谢）、GJA1（连接蛋白编码）和PRDX2（过氧化物还蛋白编码）主要在血管中表达。跨膜蛋白编码基因TMEM132D和糖基转移酶ALG5均在真皮区表达。编码CYP450蛋白的CYP4F8出现在大部分皮肤区域。

对几种免疫细胞类型进行重点研究

作者重点研究了几种免疫细胞类型，包括抗原提呈细胞（APCs）、B细胞和T细胞的两个亚群，如差异表达蛋白所示（图2j）。apc和T细胞定位于空间上不同的区域，而B细胞分布在整个组织中（图2k）。具体来说，T细胞亚群2表达了一组标记物，包括淋巴细胞激活基因3（LAG3），与外周辅助T（Tph）细胞群16 17相关（图2m），这肯定是由LAG3、PD-1和CXCR6的表达水平定义的Tph签名评分确定的（图2n）。图2.在COVID-19 mRNA疫苗注射部位的人类皮肤活检组织的综合空间和单细胞分析显示局部外周T细胞激活。

结论

Tph细胞与疫苗接种后的局部T细胞激活有关，过整合空间高蛋白质和转录组映射与scRNA-seq数据从相同的皮肤活检组织，我们确定主要皮肤和免疫细胞类型和Tph细胞高度关联，可能有助于局部免疫激活启动系统疫苗反应。

空间cite-seq技术结合了扩展了200-300大小的蛋白标记与检测，大大提高了组织定位的能力，可以广泛应用于包括癌症、免疫学、传染病和解剖病理学等领域。

教授介绍：

Rong Fan

Rong Fan，耶鲁大学哈罗德·霍奇金森生物医学工程教授，在中国科学技术大学获得学士学位，在加州大学伯克利分校获得博士学位，美国医学与生物工程研究所（AIMBE）院士，美国国家发明家学院（NAI）院士，2021年获得耶鲁大学癌症中心癌症研究奖。

Rong Fan博士的研究重点是开发和部署单细胞和空间多组学分析技术，通常基于微制设备，以研究复杂人类疾病的发病机制和治疗反应，包括癌症，自身免疫和心血管疾病。特别是，他的实验室对血液系统恶性肿瘤，脑肿瘤和系统性红斑狼疮感兴趣。他还对细胞免疫功能表征和在癌症免疫疗法中的应用感兴趣。他的实验室开发了一种微芯片技术，用于同时测量单细胞中的42种免疫效应蛋白，这是迄今为止单细胞蛋白质分泌测定的最高多重检测，已被商业化为IsoCode和IsoLight，目前被美国和世界各地的>100家制药公司和医疗中心使用。最近，他的实验室开发了一种名为DBiT-seq的基于NGS的新型方法，用于空间转录组图谱，空间高丛蛋白图谱和空间表观基因组图谱，这可能在发育生物学，癌症研究，神经科学和免疫生物学中得到广泛应用。

参考文献：

Liu, Y., DiStasio, M., Su, G. et al. High-plex protein and whole transcriptome co-mapping at cellular resolution with spatial CITE-seq. Nat Biotechnol (2023).