如何利用CRISPR/Cas9构建稳定敲除细胞系？

今天我们聊聊如何利用CRISPR/Cas9技术进行稳定基因敲除细胞系的构建，以293T细胞为例。

一些实验前的说明

• sgRNA验证：在实验开始前，可以通过sgRNA在线验证，筛选高效率的sgRNA用于敲除细胞系的构建。

• 基因拷贝数：建议在开始实验之前确定目标基因的拷贝数。许多永生化细胞系，尤其是癌细胞系，不是二倍体，因此可以具有3个或更多的染色体副本。

• 质粒的质量：使用高质量的无内毒素质粒DNA至关重要。通过读取260 nm处的吸光度确定DNA浓度。通过使用260 nm / 280 nm的比例（该比例应在1.8到2.0的范围内）来测量DNA纯度。通过琼脂糖凝胶电泳检查质粒的完整性。

• 细胞状况：使用维护良好并经过常规认证的高质量细胞，包括检测细菌，真菌或支原体污染。如果细胞来自新复苏的细胞，则在使用前至少完成2次传代。

CRISPR基因敲除细胞系实验步骤概况。

图1. CRISPR基因敲除细胞系实验步骤概况。

实验步骤

sgRNA******和genotype primers******的设计合成

1. sgRNA设计：对靶基因序列进行分析，筛选合适的靶位点，每个靶位点设计1条sgRNA。通常，将Cas9靶向编码功能蛋白结构域外显子的sgRNA比单纯靶向5'外显子更有可能消除基因功能。

sgRNA设计示意图。

图2. sgRNA设计示意图。

2. PCR引物设计：根据靶位点设计PCR引物，用于后续靶位点DNA突变检测。

载体构建

3. 根据设计的 sgRNA 序列，合成 Oligo DNA。酶切带有 Cas9 基因的空载体（带有荧光标签（GFP）和筛选基因（嘌呤霉素））得到线性化质粒，混合 Oligo DNA与线性化空载体，以T4 连接酶连接，添加 buffer 与 ddH2O，16℃连接过夜。

质粒验证

4. 将连接产物转入DH5α大肠杆菌，37℃培养过夜。挑选单菌落进行扩增，提取质粒，进行酶切鉴定。

5. 对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，挑选具有正确大小的酶切产物进行测序验证。

质粒提取与质量检测

6. 将验证的质粒转入新的DH5a感受态大肠杆菌中，37℃培养过夜。挑取单菌落进行扩增培养，提取质粒。检测内毒素；进行其吸光度检测（260 nm / 280 nm的比例在1.8~2.0）；并通过琼脂糖电泳检测质粒的完整性。

转染前

7. 转染前1天，将生长状态良好的293T细胞铺在6孔板中，每个孔的细胞约1.0 x 10⁵ -3.0 x 10⁵个。细胞培养箱中培养过夜，至90%~95%的细胞密度。

转染

8. 将转染所需试剂在37℃水浴锅中预热（包括Opti-MEM、质粒）。

9. 按照下图进行细胞转染。

细胞转染示意图。

图3. 细胞转染示意图。

单克隆筛选及鉴定

转染24 h后，即可有少部分质粒表达，在倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光。

10. 转染24 h后，在培养皿中加入终浓度为2~3 ug的嘌呤霉素进行筛选，一般筛选2~3天。

11. 用预热的PBS洗去漂浮的死细胞及血清后，加入200 ul 1◊胰蛋白酶进行消化。

12. 加入2 ml 10%血清的培养基终止消化，然后转移到无菌的15 mL离心管中。

13. 将细胞以800 x g离心3 min。

14. 将细胞沉淀重悬于5 mL10%血清的培养基中。

15. 计算血细胞计数器中活细胞的数量，以确定细胞密度。使用锥虫蓝排除死细胞，死细胞会吸收染料并变成蓝色。

16. 在50 mL无菌离心管中，在40 mL完全生长培养基中将细胞稀释至〜1-2细胞/ 200 ul的密度。从起始悬浮液中进行10倍系列稀释，以达到此细胞密度。

17. 将稀释后的细胞铺到96孔板中。为了保证能获得敲除细胞，6孔板一个孔对应至少2个96孔板。

18. 3~5天后，在光学显微镜下观察96孔板，对其中含有单细胞的孔进行标记。

19. 等到孔中的细胞密度达到70%~90%，用20 ul的1◊胰蛋白酶进行消化。

20. 加入200 ul 10%血清的培养基终止消化。吸取100 ul的细胞悬浮液，转移至1.5 ml EP管中。剩余的细胞悬浮液留在96孔板中继续培养。

21. 使用CRISPR/Cas9 genotyping试剂盒处理收集的细胞，用之前设计的PCR引物进行扩增，并将扩增产物进行测序。

22. 根据测序结果，筛选具有有效突变的单克隆。

单克隆细胞的扩增

23. 待阳性克隆细胞汇合度达到 70％以上时，依次转至 48 孔板，24 孔板，12 孔板，6 孔板中扩大培养。

24. 记录单克隆细胞的生长情况，评估细胞系的稳定性。

25. 用目的基因对应蛋白的单抗检测细胞的表达产物，裂解细胞，提取细胞的总蛋白，SDS-PAGE 电泳后转印到 PVDF膜上，封闭液封闭 1h 后，用一抗二抗先后孵育，化学发光成像仪下拍照分析。

单克隆敲除验证。

图4. 单克隆敲除验证。

支原体检测及细胞冻存

26. 用支原体检测的试剂盒检测细胞培养的上清液，PCR 鉴定，检查细胞是否遭到支原体污染。

27. 将扩增后的稳定敲除细胞进行冻存。

参考文献：

• Navin Gupta. et al. CRISPR/Cas9-based Targeted Genome Editing for the Development of Monogenic Diseases Models with Human Pluripotent Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2018; 45(1):e50.

• Jean Ann Maguire. et al. Highly Efficient CRISPR‐Cas9‐Mediated Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 2018; 48(1):e64.

• Christopher J. et al. Generating single cell-derived knockout clones in mammalian cells with CRISPR/Cas9. PeerJ Preprints. 2019; 7:e27511v1.

• Hiroshi Yamaguchi. Construction of Viral Vectors for Cell Type-specific CRISPR Gene Editing in the Adult Mouse Brain. Bio-protocol. 2019; 9(16).