✎ 文章导读
文章导读：Systems analysis and controlled malaria infection in Europeans andAfricans elucidate naturally acquired immunity
发表期刊/影响因子：Nat Immunol/2021-04/20.479
研究样本：外周血
研究内容：1）CyTOF深入分析非洲人和欧洲人恶性疟原虫静脉接种前1天、接种后5天和11天内的免疫图谱差异及动态变化；2）联合CyTOF及Bulk-RNA-seq，通过数据整合免疫细胞群、抗原特异性应答和基因表达谱，分析非洲人能够控制易感性寄生虫病的关键特征；
疟疾诱导和疫苗诱导的获得性免疫研究的缺乏，阻碍了高效率疟疾疫苗的研发。越来越多的证据表明人类的免疫反应不仅由基因决定，还受到到环境的显著影响，此外，进入临床试验的疟疾疫苗在治疗不同地理位置的感染人群时表现出较大的疗效差异。因此在深入研究疟原虫感染和免疫系统相互作用时，不仅需要研究感染和未感染群体，也需要分析暴露于不同疟疾患者地区的人群特征。
荷兰莱顿大学医学中心Maria Yazdanbakhsh及其课题组，利用质谱流式（CyTOF）对欧洲和非洲人疟疾感染的免疫学特征和动态免疫响应进行了前所未有的深度、详细研究。并通过细胞因子产生、bulk-RNA-seq转录组分析和机器学分析识别了获得性免疫反应的关键标记物以对细胞功能进行分析。
质谱流式（CyTOF）揭示个体独特稳定的免疫指纹
研究人员采集了5名欧洲人和20名非洲人疟疾子孢子（PfSPZs）静脉注射（DVI）前1天，静脉注射后5天和11天的外周血单核细胞，利用质谱流式（CyTOF）将外周血免疫细胞聚类分为9个谱系，45个细胞亚群中及198个细胞簇（Fig 1.a-d）。研究发现尽管同一个体在三个取样时间的免疫组成相似度比较高，但不同个体间的差异性较大（Fig 1. e-f）。随着时间的推移，每个个体都保留了自己独特的免疫指纹特征。
Fig.1 CyTOF揭示个体独特稳定的免疫指纹
欧洲人和非洲人的不同免疫特征
对非洲人和欧洲人的基线免疫特征分析发现，两组人群具有明显的免疫差异。如非洲人中表达 unconventional αβ T细胞，γδT细胞以及 ILC细胞亚群，而欧洲人中基本不表达这些细胞亚群（Fig 2. a）。此外，较之欧洲人，非洲人还高表达活化、分化及促炎相关的亚群。这些结果反映了非洲人暴露于可导致炎症和慢性刺激的微生物和寄生虫环境下的免疫特征。此外，对个体基线的细胞亚群进行相关性分析发现，非洲和欧洲人的免疫特征具有明显的差异（Fig 2. b）。
随后，研究人员研究了欧洲人和非洲人对PfSPZ-DVI免疫动态变化差异。研究发现相较于欧洲人在注射后的12-14天内检测到寄生虫血症，非洲人(12/20)出现TBS+的时间要更晚（13-25天，平均17.9天）(Fig 2. c)，表明肝脏和血液对寄生虫具有不同程度的免疫响应。较之感染5天内，非洲人的Treg细胞和ILC2s细胞占比增多，而欧洲人在感染的5-11天内开始增加。此外，欧洲人的经典单核细胞表现出更大幅度的频率增加，而CD141hi（BDCA3）髓样树突状细胞表现出更明显的降低（Fig 2. d）。同CyTOF数据一致，非洲人的基因表达变化主要发生在C1-D5期间，而欧洲人的基因变化发生在D5-D11之间，且非洲人群中，大多数与细胞生物学和代谢（细胞形状调节、肌动蛋白丝、氧化磷酸化）或免疫（Fc受体和血小板活化）途径的相关基因表达上调，而在欧洲人中，涉及干扰素反应的免疫途径相关基因高度上调。（Fig 2. f-g）。
为了进一步研究免疫系统是如何响应疟原虫感染的，研究人员对CyTOF数据分析发现，疟疾感染导致CD161+CD4+T细胞的活化（Fig 2. e）。此外，欧洲人的NK细胞显著降低，可能反映了这些细胞重新定位到组织或分化。有趣的是，感染前的非洲人群外周血的NK细胞频率显著降低。这些数据表明，相较于未感染者，疟疾感染似乎驱动了一种模式，这种模式类似于在暴露前的非洲人身上观察到的基线免疫模式。
Fig2.欧洲人和非洲人静脉接种恶性疟原虫子孢子前后的免疫学特征
CyTOF揭示非洲人群PfSPZ-DVI感染后与寄生虫发展控制相关的免疫特征
不同于欧洲人都能检测到寄生虫血症，非洲人群中仍有部分为TBS阴性。较之TBS+人群， TBS-免疫特征表现为CD8+NKT细胞较少，但CD161+CD4+T细胞和双阴性（DN）T细胞占比较高（Fig 3. a-b）。进一步研究发现寄生虫的控制与细胞的活跃分化状态有关，主要表现为Cluster 21（PD-1+CD161+CD4+T细胞），Cluster 63（KLRG-1+ CD8+ NKT cells）的表达占比较高，Cluster 197（KLRG-1– DN T 细胞）（几乎没有其他激活/分化标记物）表达较少（Fig 3. c-e）。
此外，PfSPZ静脉注射后，非洲人群中有四个细胞亚群变化可能与TBS-是否发展为TBS+有关。在TBS- 非洲人中，末端分化效应记忆(EMRA) CD4 + t 细胞和 γδt 细胞增加，与这些细胞存在于外周器官的可能性相一致，这些细胞对感染作出快速反应，然后进入外周血液。同时，浆细胞样树突状细胞(pDCs)的百分比显著降低，这种细胞通过从血液中进入组织和/或次级淋巴器官，可以引起进一步的 T细胞反应（Fig 3. f）。对其RNA-seq进一步研究发现TBS-非洲人群的差异基因主要跟激活（细胞代谢及胞内响应）路径相关，基因富集分析发现了TBS-非洲人群中2条与干扰素 γ相关的通路（Fig 4）。
综上所述，通过使用 CHMI，可以将被鉴定为 CD4 + T 细胞的子集和集群，特别是 EM 和 CD161 + CD4 + T 细胞、 NKT 细胞、 DN T 细胞和 γδT 细胞以及 pDCs 与获得性免疫联系起来。这些细胞通常表现出分化/激活标记，可能描绘出控制疟疾流行地区终身居住的非洲人的寄生虫血症的更强有力的效应反应。与此相一致的是，对转录组的分析揭示了一组基因的变化，这些基因指示了 TBS-非洲人的早期细胞活化。
Fig 3.非洲人群PfSPZ-DVI后与寄生虫发展控制相关的高维免疫特征
Fig 4.非洲人群PfSPZ-DVI 外周血基因表达
恶性疟原虫感染红细胞时细胞因子的产生
研究人员用恶性疟原虫感染的红细胞（PfRBCs）细胞去刺激PBMC，研究发现虽然CD8+T细胞产生细胞因子的差异不显著，但CD4+细胞的适应性免疫反应是比较明显的。较之欧洲人，非洲人CD4+细胞对恶性疟原虫抗原的反应要更强烈，CD4+细胞能够分泌更多的IFN-γ和TNF（Fig 5.a-c）。此外，同质谱流式细胞的数据一致，较之TBS+非洲人群，TBS-非洲人的IFN-γCD4+T细胞占比增多，TNF+CD8+NKT细胞的频率较低（Fig5. e-f）。随着感染的时间变化，EMRA CD4 + t 细胞在 TBS- 非洲人 D5和 D11之间的频率增加，但TNF因子分泌反而下降（Fig 5. g）。这一过程似乎是在早期被激活后的低应答现象。
Fig 5 . 恶性疟原虫感染红细胞时细胞因子的产生
多组学提示CD161+CD4+T产生IFN-γ抵抗疟疾感染
为进一步了解哪些细胞簇、基因和抗原特异性反应与自然获得的抗疟性最密切相关，研究人员使用机器学习算法对非洲人和欧洲人（Fig 6. a）、TBS+和TBS-( Fig 6. b)进行样本分析及特征鉴别。研究分析得到一组跟欧洲人相关的免疫特征，包括naïve CD4+T细胞、CD8+细胞、NKT细胞、以及NKX3-1同源蛋白、肌动相关蛋白2/3复合体抑制剂（ARPIN）、OLFM1、LRRC6)基因，研究还发现了与抗寄生虫相关的特征，包括CD161 + CD4 + T细胞亚群和产生IFN-γ的 (EM) CD4 + t 细胞(Fig 6. e-f)。进一步研究发现与 CD161-CD4 + T细胞相比，CD161 + CD4 + T细胞在 PfRBC 刺激下产生IFN-γ 的能力增强(Fig 6. g)。
CD161 + CD4 + T细胞作为一个与控制寄生虫血症有关的突出特征，促使研究人员进一步研究其功能相关性。为此，从研究对象血清中检测了228种恶性疟原虫特异性抗原的蛋白质芯片，并在基线上鉴定出5种与 TBS-组寄生虫对照相关的蛋白质(Fig 6. h)。研究发现 CD161 + CD4 + T细胞的频率与其中两种抗体反应呈相关性，并有两种以上的趋势(Fig6. j)。这表明 CD161 + CD4+ T细胞在控制寄生虫血症中可能发挥重要作用。
Fig 6. 综合数据分析
文章总结
在该研究中，研究人员使用质谱流式细胞技术（CyTOF）、RNA测序和数据整合方法，在恶性疟原虫静脉接种前、接种后的5天和11天内，对静脉注射疟原虫的欧洲人和非洲人的免疫特征进行了比较。研究人员观察到欧洲人和非洲人之间以及免疫力不同非洲人之间的免疫细胞群、抗原特异性应答和基因表达谱差异。接种前，先天和适应性细胞的激活/分化状态，包括CD161+ CD4+ T细胞增加和干扰素-γ产生增强，都预示着非洲人控制寄生虫病感染能力越强。接种后，CD4+ T细胞、浆细胞样树突状细胞和先天性T细胞的转录和细胞簇反应快速性是区分非洲人能够控制易感性寄生虫病的特征。这些发现有利于在疟疾流行地区研发有效疫苗。
【参考文献】
de Jong SE, et al. Systems analysis and controlled malaria infection in Europeans and Africans elucidate naturally acquired immunity. Nat Immunol. 2021.
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