免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）是使用能够特异性结合目的蛋白质的抗体将目的蛋白从溶液中沉淀出来的技术。该方法可从含有数千种不同蛋白质的样品中分离和浓缩目的蛋白。
免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, co-IP）是指在合适的buffer条件下利用免疫沉淀的原理沉淀出目的蛋白和与目的蛋白相互作用的其他分子。这种分子可以是蛋白质，也可以是DNA（也称Chromatin immunoprecipitation ，ChIP），也可以是RNA（也称RNP Immunoprecipitation，RIP）。沉淀下来相互作用蛋白可以通过western blot或者质谱搜库鉴定。而相互作用DNA和RNA可以通过测序鉴定。
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IP原理：细胞裂解后，目的蛋白抗体（Primary antibody）与样品中的目的蛋白（Protein complex）形成免疫复合物。 然后将免疫复合物捕获或沉淀在固定有抗体结合蛋白的珠子上（Secondary antibody, Protein A, Protein G or Protein A/G ），并且洗掉未沉淀在珠子上的任何蛋白质。 最后，从珠子上洗脱抗原（如果抗体不与珠子共价连接或使用变性缓冲液时，抗体也会被洗脱），并通过western blot或者质谱鉴定相关蛋白。
免疫共沉淀原理图（图片来源于网络，侵删）
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Recipes:
lysis buffer:
20mM Tris/HCl, pH7.6, 150mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors
理想的裂解缓冲液应最大限度地减少蛋白质变性，同时从样品中释放出足够量的蛋白质。非离子型洗涤剂如NP-40和Triton X-100一般不会使蛋白质变性。离子洗涤剂如SDS和脱氧胆酸钠会使蛋白质变性。 影响免疫沉淀的其他变量包括盐浓度，二价阳离子浓度和pH。可加入10-15%的甘油来降低水的活度，降低可溶性的蛋白的降解，其粘性又可稳定蛋白质之间的相互作用。
Wash buffers：
10mM Tris/HCl, pH 7.6, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 150mM NaCl, 0.1% NP-40
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影响co-IP结果的因素如下：
1. 去垢剂（detergent）
NP-40、Triton X-100等去垢剂能够削弱蛋白质之间的非特异性结合。如果去垢剂在裂解缓冲液中的浓度偏高，可能会检测不到蛋白质间的相互作用。但是，如果去垢剂在裂解缓冲液中浓度偏低或者没有，可能出现非特异性结合的假阳性结果。co-IP时去垢剂的浓度尽量在0.2-0.5%，若高于这个浓度可能使染色质析出造成溶液的粘稠。如果co-IP过程中发现溶液粘稠，需要进行超声切断DNA（超声可能会打断蛋白质间的相互作用）。可以使用1% NP-40的裂解液细胞后再用不含NP-40的裂解液稀释NP-40的浓度，这样可以保证裂解充分的同时又利于co-IP。膜蛋白对于去垢剂种类和构想非常敏感，所以膜蛋白的co-IP需要尝试不同种类和不同浓度的去垢剂。
2. 盐离子浓度
150mM NaCl为生理条件下的盐离子浓度。一般不用钾盐，钾离子会与一些试剂形成沉淀，例如SDS。一般来说，在生理盐浓度下蛋白质间如果有相互作用，则此蛋白质复合体不会解体。不同的蛋白质复合体对盐离子浓度的敏感性不同，有的蛋白质复合体甚至能够耐受几倍于生理盐浓度的盐离子浓度。裂解缓冲液中NaCl浓度低于150mM会大大增加假阳性的几率，而且对染色体相关蛋白提取效果较差，并且此并非是一种检测瞬间相互作用或弱相互作用的手段。
3. 蛋白浓度
蛋白浓度会影响蛋白质之间的相互作用。蛋白质浓度越高越容易检测到相互作用，但是这种检测到的相互作用可能是因为浓度高所带来的假阳性结果。所以，在过表达检测到相互作用后要做內源的co-IP进一步验证。对于內源蛋白，co-IP时蛋白浓度越高越容易检测到相互作用。如果蛋白浓度较稀，某些相互作用就无法检测到。因此，一般至少1个90%confluence以上的 6 cm dish的细胞量来做相互作用。当第一次检测两个蛋白质间的相互作用，为了实验出现阳性信号和良好的稳定性，推荐使用2个90%confluence以上的 10 cm dishes。
4. lysis buffer 和 wash buffer 盐离子浓度
一般lysis buffer 和 wash buffer 盐离子浓度相同。若lysis buffer 盐离子浓度高，wash buffer 盐离子浓度低，不利于杂蛋白去除；若lysis buffer 盐离子浓度低，wash buffer 盐离子浓度高，会造成蛋白质的损失。
5. 外源蛋白co-IP时标签的选择
His tag：HHHHHH 该标签由罗氏发明（专利已过期）。有一定量的內源蛋白质含有HHHHHH的结构域，因此当用Ni-NTA去IP目的蛋白时，会同时沉淀下来许多含HHHHHH的结构域与实验体系无关的蛋白质。His的优点是Ni-NTA并非是抗体，十分廉价，并且用咪唑洗脱效果好价格低，并可用内肽酶切除此标签，适合用于大量纯化蛋白质的研究，例如蛋白质结构。
Flag tag：DYKDDDDK Flag tag是理想化的人工设计的表位标签。其结构经过优化，可与其附着的蛋白质相容，因为它具有很强的亲水性，因此不太可能使其附着的蛋白质变性或失活。Flag tag中的酪氨酸残基可以被硫酸化，这会影响flag抗体识别。肠肽酶可以切除此标签。一般认为，Flag抗体的效价普遍比HA抗体高。因此，Flag tag是一个理想的co-IP标签。目前看来唯一的缺点是Flag抗体价格昂贵（sigma专利，未过期）。
Myc tag：EQKLISEED myc tag是衍生自c-myc基因产物的多肽蛋白标签，但是仍然会被內源蛋白质干扰。
HA tag：YPYDVPDYA HA tag衍生自氨基酸98-106的流感病毒HA蛋白。HA tag不适合检测或纯化凋亡细胞中的蛋白质，因为它在序列DVPD后被Caspase-3和/或Caspase-7切割，导致其失去免疫反应性。
GST tag GST tag的大小为220个氨基酸（大约26 KDa）。GST蛋白对GSH具有很强的结合亲和力，所以可以通过GSH纯化GST tag的蛋白质。co-IP后可用游离的GSH洗脱。因其成本低，适合用于大量纯化蛋白质的研究，例如蛋白质结构。许多商业上的GST标记质粒包括凝血酶结构域，此结构域可用于在蛋白质纯化过程中切割GST标签。
Tandem mass tag（TMT） 专为通过串联质谱（MS）对不同样品中的蛋白质进行鉴定和定量而设计。其目的为使外源性蛋白的表达水平处于极低状态用于模拟体内环境。目前有五种TMT可供选择：①TMTzero；②TMTduplex；③TMTsixplex；④TMT 10-plex；⑤TMT11plex。其并且洗脱试剂价格低廉。用此标签纯化的蛋白质后质谱分析结果更全面、更精确、更高效。但是，TMT会结合內源的钙调蛋白，因此不能分析钙信号通路。
6. 添加标签的位置
将tag添加的蛋白的N端或C端可能会影响蛋白质的结构和功能，也会影响蛋白质间的相互作用。主要考虑信号肽的问题。例如，流感病毒HA蛋白的信号肽在N端，如果将tag加在HA的N端，那么HA的信号肽在被信号肽酶切割的时候会同时将tag切除，这将导致无法检测和纯化到HA蛋白。因此，在克隆基因时，建议同时做两个克隆，一个标签在N端，一个标签在C端。
7. 对照的选择
co-IP需要有严格的阳性对照和阴性对照。已经发现两个蛋白质之间存在相互作用，用这两个蛋白做co-IP称为阳性对照。阴性对照为：①lgG对照；②protein A/G对照；③珠子对照。若为外源的co-IP，阴性对照还应增加过表达一个蛋白质时的对照。
8. IP对象的选择
一般根据实验室可用的材料选择可行。如果材料充足的话，建议IP分子量大的蛋白或丰度低的蛋白，检测另一个蛋白。
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Protocol：
细胞裂解物的准备：
1. 将细胞培养皿置于冰上并用预冷的PBS洗涤细胞。
2. 去除PBS，然后加入预冷的细胞裂解液。
3. 使用预冷的细胞刮刀将粘附的细胞从培养皿上刮下，然后将细胞悬浮液轻轻转移到预冷的EP管中。
4. 加入lysis buffer后，在4°C下保持静止或者旋转30分钟。
注：lysis buffer的体积需自行摸索。一般6 cm dish 100% confluence加150-400μL的lysis buffer。
5. 在4℃条件下12000g离心20分钟。
注：少数贴壁细胞离心的离心力和时间会有所不同，需自行摸索。
6. 轻轻地从离心机中取出EP管并置于冰上，取部分上清液为全细胞裂解液（whole cell lysate or input）。
7. 将剩下的上清液移至新的预冷EP管中，弃沉淀。
免疫共沉淀：
离心去除细胞碎片后的上清是一个刚好的溶解平衡体系，添加其他物质如珠子这类可作为沉淀凝结核的物质会破坏原本的溶解平衡，让一些原本溶解完全的蛋白发生沉淀。那么，珠子翻转越久蛋白会沉淀越多，而这种沉淀无法靠漂洗去除干净，最终可能检测到任意蛋白的结合。因此，推荐先加抗体再加入珠子。一般离心珠子3000-4000xg已经足以，再高的离心力会使珠子破碎，不利于回收再生使用。
1. 在上述步骤7中的EP管中加入适量的目的蛋白抗体。
注：抗体浓度根据说明书或者预实验结果，取决于抗体的效价。如果目的蛋白或相互作用蛋白在55KD和25KD左右，应选用不同种属的抗体分别做IP和IB以避免重链和轻链的干扰。
2. 将EP管在4℃条件下孵育1-12小时，推荐在温和搅拌或旋转条件下孵育。
注：孵育时间取决于目的蛋白浓度和抗体的亲和性。如果目的蛋白抗体已经偶联珠子，跳过步骤3和4。
3. 孵育结束后，向EP管中加入合适量的偶联Protein A/G 的珠子。
注：偶联Protein A/G 的珠子可提前加入lysis buffer和whole cell lysate去除背景。
4. 将EP管在4℃条件下旋转搅拌孵育1-2小时。
注：珠子加入的量根据说明书或者预实验结果。限制珠子翻转孵育时间非常关键；通常珠子孵育1-2小时已经充分结合了。
洗涤：
1. 沉淀上述步骤4的EP管中的珠子。如果珠子为Agarose，通过离心将珠子沉淀（建议4℃, 1000-3000xg离心2分钟；也可4℃, 12000xg点离，但可能会损坏珠子）。如果珠子为magnetic beads，通过磁力架将珠子沉淀。
2. 取部分上清液作为flowthrough，去除剩下上清。
3. 使用洗涤缓冲液洗涤珠子三次（前两次为0.1%NP-40的wash buffer，最后一次为不含NP-40的wash buffer）以除去非特异性结合。每次洗涤，4℃条件下沉淀后弃去上清液。
注：洗涤时间和次数根据相互作用强弱和非特异性结合强弱有所差异。较弱的相互作用，可以洗涤一次。
洗脱：
目前有四种方法洗脱目的蛋白复合物：①甘氨酸缓冲液洗脱；②SDS缓冲液洗脱；③尿素缓冲液洗脱；④抗体的peptide。
①甘氨酸缓冲液洗脱：
在该方法中，使用含有0.1-0.2M甘氨酸，pH2.0-3.0的缓冲液通过酸化从珠子上洗脱目的蛋白复合物。甘氨酸的低pH会削弱抗体和珠子之间的相互作用。洗脱的样品应立即用pH值8.0-8.5的Tris中和。此法优点在于去除甘氨酸缓冲液后可以重复使用珠子。交联了抗体的珠子非常昂贵，再生珠子可以节约经费，一般珠子可以用塑料层析柱再生使用20-30次。一般，囤积了比较可观的珠子后（大于 1ml），高转速旋转过夜，再用酸（0.1-0.2M Glycine-HCl）和高盐（3M NaCl）洗去除珠子上残留的蛋白，然后加入至少50%甘油含叠氮钠的缓冲液保存在4℃。但是，高盐和酸洗无法彻底清除珠子上的十分粘稠的蛋白。再生后的珠子有利于减少重链和轻链的背景，用于银染可以得到较为纯净的背景。
1. 于EP管中加入3倍珠子体积的0.1-0.2M, pH2.0-3.0的甘氨酸缓冲液，频繁搅拌下将样品孵育10分钟。
2. 孵育结束后离心，用合适体积的Tris pH 8.0中和洗脱液。
②SDS缓冲液洗脱：
通过在SDS loading buffer加热或煮沸样品，从珠子上洗脱目的蛋白复合物。此法优点在于样品浓度可以更高。
1. EP管中加入与珠子体积相等的2x SDS上样缓冲液后，在95°C加热3-10分钟洗脱目的蛋白复合物。
注：缺少DTT的2x SDS上样缓冲液洗脱可减少IgG背景。
③尿素缓冲液洗脱：
此法优点在于样品可以被蛋白水解酶消化，利于质谱分析。
1. 加入2-5被珠子体积的尿素洗脱缓冲液并在室温下旋转或频繁搅拌30分钟，然后离心取上清液。
④抗体的peptide洗脱：
抗体的peptide通过与目的蛋白竞争结合抗体洗脱目的蛋白复合物。最常见的为Flag等标签的peptide。但His标签比较特殊，一般用咪唑洗脱。此法优点在于所得的目的蛋白复合物具有生理活性，但是洗脱效果较低。
在任何一种情况下，应仔细评估细胞裂解方法和洗涤条件，因为蛋白质复合物中的蛋白分子通常通过弱相互作用保持在适当位置。
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参考资料：
1. Abcam
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