前言
2020年1月，Maarten Altelaar课题组在Mol Cell Proteomics杂志（IF=4.87）发表题为“Combined EGFR and ROCK inhibition in TNBC leads to cell death via impaired autophagic flux”的研究论文，该研究运用磷酸化蛋白质组学报道了EGFR 和ROCK两种抑制剂可促进三阴性乳腺癌细胞死亡，本文对其具体的作用做了深入的探索与反复验证。
中文标题：EGFR和ROCK的双重作用可通过提高自噬通量导致三阴性乳腺癌细胞死亡
研究对象：MDA-MB-231 和 Cal120 细胞
发表期刊：Mol Cell Proteomics
影响因子：4.87
运用生物技术：蛋白组质谱鉴定；western blot；磷酸化蛋白质组学
研究背景
三阴性乳腺癌是一种临床上很难治愈的乳腺癌亚型。有报道显示EGFR和ROCK的双重作用可以导致细胞死亡，但是其作用机制尚不明确。为了进一步探究其作用机制，Maarten Altelaar教授团队基于质谱蛋白质组学，研究了EGFR和ROCK单独或者双重处理后，TNBC细胞中的蛋白质表达变化。结果发现，吉非替尼的单独处理导致细胞发生自我吞噬，然而EGFR和ROCK同时处理细胞则封锁了细胞吞噬过程，从而导致吞噬小泡的积累。
研究思路
研究方法
1.实验材料
MDA-MB-231和Cal120 细胞（全部排除支原体污染）；吉非替尼（EGFRi, MedChem），GSK269962A（ROCKi, Axon）。
2.检测方法
(1)分别使用DMSO， EGFRi，ROCKi 和 (EGFRi+ROCKi)处理2天后，收集MDA-MB-231和Cal120 细胞，每种细胞3次技术重复。
(2)深度蛋白组：每个样本取50μg混合，pH=10流动相下梯度分离，最终合并为5个组份。
(3)磷酸化蛋白质组学：Fe(III)-IMAC富集磷酸化肽段，然后使用QE HF质谱仪进行鉴定。
(4)Western Blot：共验证以下7个蛋白：LC3 (5F10, Nanotools), p62 (610832, BD Biosciences), AMPKThr172 (40H9, Cell Signaling), rpS6 (5G10, Cell Signaling), rpS6Ser235/236 (Cell Signaling), Hsp90 (sc-7947,Santa Cruz), Actin (AC-74, Sigma).
(5)通过Cyto-ID染色对细胞自噬通量进行检测与定量。
研究结果与讨论
1.不同条件处理下细胞变化
使用DMSO (control), gefitinib (EGFRi), GSK269962A (ROCKi) 和(EGFRi+ROCKi)混合抑制剂分别处理四组细胞（样本策略），可以明显地看出EGFRi+ROCKi抑制了细胞的增长（Figure 1A）。进一步，做了全蛋白组和磷酸化蛋白质组测定，共定性出7169个蛋白质和22758个磷酸化位点（Figure 1B），选择其中至少在两个重复中有定量值的蛋白和位点进行后续分析。从Figure 1C和Figure 1D均可以看出，本次实验的技术重复性很好，且不同处理组之间也能很好的区分开。
图1 | 实验流程与质谱数据展示
2.蛋白组定量数据聚类及GO分析
通过ANOVA统计分析，共筛选出995个表达差异蛋白，并对差异蛋白进行HCA聚类，结果共得出3个大类，即1类EGFRi+ROCKi处理后下调的蛋白（cluster A）和2类上调的蛋白（cluster B和cluster C）。分别对三个分类进行GO分析，结果显示cluster A中的下调蛋白与细胞粘附、染色质重组等生物学过程相关。Cluster B的上调蛋白与氧化还原等，尤其是细胞自噬相关。Cluster C的高表达蛋白则与胞内蛋白转运、细胞粘附等密切关联。
图2 | 不同处理后细胞蛋白组聚类
3.细胞自噬相关蛋白的差异表达
EGFRi、ROCKi和 (EGFRi+ROCKi)混合抑制剂分别与DMSO对照组处理的蛋白定量值进行差异筛选（Figure 3A），并展示了这些差异蛋白中与细胞自噬等生物学过程相关蛋白之间的相互作用，因此发现了LC3、rpS6等重要的细胞自噬受体（Figure 3B）。
图3 | EGFRi, ROCKi 和 EGFRi+ROCKi不同处理后细胞蛋白组与对照组的差异表达
4.Western blot验证细胞自噬相关的蛋白标志物
首先，选用MDAMB231细胞验证在四种预处理过程中，自噬标志物的表达变化和rpS6的磷酸化水平，结果显示在EGFRi+ROCKi的双重作用时，rpS6的磷酸化修饰被显著抑制。然后，选用Hs578T、Cal120和HCC1806细胞验证LC3-II的表达变化和rpS6的磷酸化，结果再次印证了rpS6的磷酸化受到EGFRi+ROCKi双重作用的抑制，且LC3-II表达明显升高。
图4 | 蛋白标志物的抗体验证
5.细胞自噬流分析
培养Hs578T细胞，分别使用EGFRi和EGFR+ROCKi抑制剂进行处理，然后通过Cyto-ID对自噬小泡进行荧光计数，结果发现，使用EGFR+ROCKi混合抑制剂处理后的细胞自噬作用加强（Figure 5），因此进一步印证EGFR和ROCKi的双重作用对增强三阴性乳腺癌细胞的自噬作用显著提升。
图5 | EGFRi与混合抑制剂分别对细胞自噬的影响
实验结论
本文通过蛋白质组学数据分析发现EGFR和ROCK对三阴性乳腺癌细胞的双重作用可以增强其自噬作用，从而导致癌细胞死亡，并从多个角度进行验证，从而为该癌症的临床治疗提供了理论依据。
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三阴性乳腺癌在临床上的治愈效果不佳，给病人和家属造成极大的痛苦。本文研究中，作者通过蛋白质组学和磷酸化位点鉴定的方式，观察了不同药物对于细胞自噬的影响，初步确认了EGFR和ROCK双重作用可提高细胞自噬，促进细胞死亡。然后又通过Western blot和荧光计数计数，进一步验证了以上结论，为临床药物治疗提供了有力的理论依据。
部分参考文献：
1.Foidart, P., et al., Expression of MT4-MMP, EGFR, and RB in Triple-Negative Breast Cancer Strongly Sensitizes Tumors to Erlotinib and Palbociclib Combination Therapy. Clin Cancer Res, 2019. 25(6): p. 1838-1850.
2.Bryant, K.L., et al., Combination of ERK and autophagy inhibition as a treatment approach for pancreatic cancer. Nature Medicine, 2019.
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文章来源于鹿明生物
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