Genome-wide Discovery and Identification of a Novel miRNA Signature for Recurrence Prediction in Stage II and III Colorectal Cancer
在全基因组范围内发现并鉴定用于预测II期和III期结直肠癌复发的新型miRNA特征
发表期刊：Clin Cancer Res
发表日期：2018 Aug 15
影响因子：9.492
DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-17-3236
一、研究背景
结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一。CRC患者的存活率主要与诊断时的肿瘤分期有关，所有分期的5年相对存活率为65%，I期约为93.2%，II期为82.5%，III期为59.5%，IV期为8.1%。手术后，30%的II期和50-60%的III期CRC患者在5年内出现复发。虽然普遍认为Ⅲ期CRC患者辅助化疗可以提高患者的生存率，但由于缺乏识别真正高危患者的风险分层，在Ⅱ期癌症中使用此类治疗仍有争议。总的来说，开发识别真正的高危人群II期和III期CRC患者的分子标志物十分必要。
二、材料与方法
1 数据来源
1）公开数据库：TCGA公开数据集（N=158和107），GSE29623数据集（N=40）
2）两个临床验证队列，包括431名接受手术而未进行新辅助化疗的II期和III期CRC患者
临床验证队列
2 分析流程
流程图
三、结果展示
01 - 识别在AML中差异表达的IRGs
作者进行了全基因组、无偏倚的生物标志物发现，以确定miRNA特征，从而对低风险和高风险的II期和III期CRC患者进行分层。由于TCGA数据集由来自两个不同平台的miRNA测序谱组成，将其中一个用于生物标志物发现（TCGA-HiSeq，N=158），另一个用于验证（TCGA-GA，N=109）。
在TCGA-HiSeq发现队列中，比较了至少随访3年的高危组和低危组之间的miRNA表达谱，发现了25个绝对对数2折变化差值为0.2、p值小于0.05（Wilcoxon符号秩检验）、平均表达水平大于3个转录本/百万的目标。基于多变量cox回归分析，使用共25个miRNAs，进一步选择了8个具有顶级统计学意义(p值<0.2)的候选者，其中包括hsa-mir-191、hsa-mir-200b、hsa-mir-30b、hsa-mir-30c2、hsa-mir-33a、hsa-mir-362、hsa-mir-429和hsa-mir-744(图2A)。
使用Kaplan Meier和对数秩分析进一步验证MRC可显著预测所有三个队列中的RFI：TCGA-HiSeq队列（图2B），TCGA-GA队列（图2C），以及GSE29623队列（图2D）。两个验证队列预测肿瘤复发的AUC值分别为0.79和0.88，突出了miRNA分类器的有效性。
图2 miRNA分类器Volcano图和KM曲线预测TCGA发现、验证和GSE验证队列中的无复发区间
接下来调查MRC是否可以预测复发，无论CRC患者的CMS亚型如何。TCGA队列的CMS标签是从CRC亚型联盟(CRCSC)的资料库中获得的。长排序分析表明，无论基因表达亚型如何，我们的MRC都能显著预测TCGA两队列的RFI（图2E和F）。特别是对于复发的预测，我们的MRC在两个TCGA队列中都显著优于CMS分类器（图S3）。
图S3 CMS和MRC的复发预测比较
02 - miRNA分类器在CRC II期和III期患者新鲜冷冻组织中的验证
为了确定从in-silico数据集得出的MRC是否稳健，作者首先评估了其在队列-1中的表现，该队列由127名来自II期和III期CRC患者的新鲜冷冻组织组成。测量了CRC组织中所有8个miRNA的表达水平，并使用Cox's比例危险模型来建立一个预后分类器。如图3A所示，MRC衍生的低危与高危患者的5年RFI从87%显著下降到63%，危险比（HR）为3.44。II期患者的HR为7.54（图3B），而III期为4.23（图3C）。此外，MRC在两个阶段都达到了0.70的AUC，II期与III期CRC患者的复发预测率更优。
在单变量分析中，在三个重要变量中，MRC成为预测复发最强的变量，而不是肿瘤阶段和淋巴侵犯。在多变量分析中，MRC仍然是唯一显著的复发预测因子。从临床的角度来看，基于MRC的风险分层在预测II期CRC患者的复发方面具有显著性，而NCCN标准则不起作用（图3D）。
图3 临床队列1中预测鲜冻标本无复发间隔的阶段性生存曲线
03 - 在独立的FFPE队列中训练和验证miRNA分类器
为了评估MRC在识别高危患者的转化潜力，作者检查了其在FFPE组织中的表现。为此，将大型FFPE队列分为训练组（队列2）和验证组（队列3）。使用Cox比例危险模型，在8-miRNA签名上训练了一个分类器，随后将该模型得出的系数应用到验证队列中。
训练队列中每个患者的风险评分如下：MRC风险评分=（-0.1218×miR-744）+（-3.7142×miR-429）+（-2.2051×miR-362）+（3.0564×miR-200b）+（2.4997×miR-191）+（-0.0065×miR-30c2）+（2.2224×miR-30b）+（-1.1162×miR-33a）。
基于Cox模型得出的风险评分（图4A和G），使用-0.04的截止阈值，将训练队列和验证队列的患者分层为MRC低风险组和高风险组。当评估风险评分和复发状态的分布时，观察到高危患者与低危患者在两个队列中的RFI显著缩短，HR分别为6.15和4.23。同样，在训练队列和验证队列中，II期和III期高危患者的5年无复发概率分别为56%和57%，而低危患者的5年无复发概率分别为91%和88%（图4B和H）。为了验证阶段性的肿瘤复发风险，分别对各阶段进行对数秩分析。与队列1的结果一致，除了对两个阶段进行了很好的风险分层外，两个队列中II期患者的HRs也明显较高（图4C、D和I、J）。
接下来通过进行ROC分析来评估miRNA分类器在复发预测方面的准确性。如图4E和K所示，MRC在预测两个队列中II期和III期患者的复发方面分别达到了0.71和0.77的AUC。单变量分析显示，与MRC一起，肿瘤分期和淋巴侵犯在预测II期和III期CRC患者的复发中显著相关。然而，在多变量分析中，MRC成为两个队列中唯一显著预测肿瘤复发的因素。鉴于这些发现，将MRC风险评分与肿瘤分期和淋巴侵犯相结合，进一步提高了两期CRC患者复发预测的AUC，在训练队列和验证队列中分别为0.76和0.80（图4E和F）。
与队列1的情况一样，与NCCN标准和其他临床病理变量失败的情况相比， MRC成功地识别了真正的、高危的、II期CRC患者，准确率非常高；并且优于目前可用的Coloprint和Oncotype Dx检测的预测准确率，尤其是在FFPE标本中（图4F和L）。
图4 临床队列2和3中FFPE标本中miRNA复发分类器的训练和验证
04 - MRC预测CRC患者肿瘤复发与辅助化疗状态无关
在临床验证队列中，有很大一部分患者接受了辅助化疗，这可能会潜在地影响肿瘤复发预测。为了评估任何这种潜在的混杂效应，作者分别分析了接受和未接受5FU为基础的化疗的II期和III期患者中MRC衍生的风险亚组和肿瘤复发之间的关联。在未经治疗的患者中，我们的MRC仍然与II期和III期CRC患者的不良RFI显著相关（图S2，A、B、C和D）。相反，在接受5FU的患者中，虽然在II期患者中没有看到任何显著的关联（可能是由于样本量小），但注意到MRC在识别高风险III期患者方面是稳健的（图S2，E，F，G和H），突出了其复发预测潜力，无论CRC患者的辅助化疗状态如何。
图S2 无论辅助化疗治疗如何，MRC都能显著预测无复发间期
05 - MRC低风险微卫星稳定的患者可从单独的5FU辅助治疗中获益
在FFPE队列中(队列2和3)，只有氟嘧啶进行了辅助化疗。为了估计MRC是否可以预测III期患者氟嘧啶辅助化疗的获益，作者调查了接受和不接受氟嘧啶辅助治疗的患者中MRC风险和RFI之间的关联。虽然将MSI患者纳入分析时没有显著差异（图S4A、B、C、E、F和G），但在微卫星稳定患者中的分析显示，在III期MRC低风险患者群体中，接受氟嘧啶辅助治疗与5年无复发概率的显著增加相关（接受化疗的5年RFI 87% vs. 不接受化疗的67%，HR：3.57）（图S4H）。另一方面，在III期MRC高危患者群体中，接受和不接受氟嘧啶辅助治疗的患者之间没有显著差异（图S4D）。
图S4 MRC能显著预测微卫星稳定的III期结直肠癌辅助化疗的获益情况
四、结论
总之，我们提供了一个新的证据，即我们基于miRNA的复发分类器可以根据临床结果有效地将II期和III期CRC患者分层为高危组和低危组。这种新型的miRNA-复发分类器的工作原理优于目前使用的临床病理特征以及NCCN标准，并且在识别高危CRC II期和III期患者时不受辅助化疗状态的影响。这在临床实践中可以随时部署，利用FFPE标本进行决策，有待进一步的模型测试和验证。
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