24型

三. apoptosis

1. 凋亡通路核心分子家族成员有两个：Bcl-2 家族和 Caspase 家族。Bcl-2 家族成员中，有一 类 抑制凋亡的分子，以 Bcl-2 分子为代表；Bcl-2 家族成员中，还有一类促进凋亡发生的分 子，以 Bax 分子为代表。Caspase 家族成员中，一类是凋亡启动分子，包括 Cas-2,8,9 和 10； 一类是凋亡效应分子，包括 Cas-3、6 和 7；还有一类 caspase 的亚家族分子和凋亡的关系不 大。

2. 介导凋亡的通路有三条：1）线粒体通路；2）内质网通路；3）死亡受体通路。
   1）线粒体通路，是最重要的介导凋亡的通路。在线粒体通路中，细胞色素 C 的释放是关键 步骤。释放的细胞色素 C 和 Apaf-1 以及 Pro-cas-9 形成复合物，激活 Cas-9。激活后的 Cas-9， 再激活 Cas-3 和 7，向下传递凋亡信号。
   2）内质网通路：当内质网内 Ca2+离子失调或者内质网内蛋白过量积累，激活内质网通路。 在内质网通路中，涉及到 Cas-7，Cas-12 和 Cas-3 的参与。
   3）死亡受体通路是最为复杂的。最常见的死亡通路信号是 FasL-Fas 通路和 TNF-TNFR 通路。

3. 检测凋亡的方法有很多，包括：1）基于显微镜观察的形态学检测；2）AnnexinV-PI 双染 色实验，结合流式细胞仪检测；3）DNA 片段检测法；4）ELISA 检测法；5）TUNEL 法；6） 线粒体跨膜电位检测法；7）明星分子检测。部分实验方法在扩展阅读内容中有介绍。

• 1）AnnexinV 阴性且 PI 阴性（双阴性细胞），这类细胞是活细胞； 2）AnnexinV 阳性且 PI 阴性，这类细胞是早期凋亡的细胞； 3）AnnexinV 阳性且 PI 阳性（双阳性细胞），这类细胞是晚期凋亡或者是坏死的细胞； 4）AnnexinV 阴性且 PI 阳性，这种情况可能是由于非特异性染色导致的。因为 AnnexinV 阴性，表示磷酯酰丝氨酸没有外翻，说明细胞膜依然具有完整性。PI 不能透过完整性的细 胞膜和细胞核结合，因此从理论上讲，不存在 AnnexinV 阴性而 PI 阳性的细胞。

4. wb检测：

• 结合线粒体通路，首先是检测激活的 Cas-9。然后激活的 Cas-9 再级联放大激活下游的 Cas-3，所以 Cas-9 和 Cas-3 几乎是逃不掉的两个明星分子。前体分 子是 Pro-cas-9 和 Pro-cas-3。
• 抑制凋亡的 Bcl-2 和促进 凋亡的 Bax。因此，常常通过 western 检测 Bcl-2 和 Bax 的表达量，通过 Bcl-2/Bax 的比值， 表征细胞凋亡的程度。

九.泛素化

泛素-蛋白酶体（ubiquitin-proteasomesystem，UPS）的关键组分介绍
泛素化过程通常由泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）介导。在泛素蛋白酶体系统中，含有多个关键的组分：泛素、泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、 泛素蛋白连接酶（E3）、去泛素化酶（DUB）和蛋白酶体。我们分别介绍如下：
（1）泛素
泛素是一个由 76 个氨基酸组成，分子量仅为 8.5kDa 的小肽，序列高度保守，且普遍存在 于真核细胞内。泛素分子内部含有 7 个赖氨酸残基，分别是 K6、K11、K27、K29、K33、 K48、K63 和 1 个 N 末端甲硫氨酸残基（M1）。泛素分子可以通过自身的上述 7 个赖氨酸 残基和 1 个 N 末端甲硫氨酸残基，和另一个泛素分子结合。泛素与泛素之间的结合方式， 又可以分为同型的多聚泛素化修饰和异型的多聚泛素化修饰。所谓的同型的泛素化修饰指的 是，靶蛋白泛素链上的每一个泛素分子之间都通过同样一个氨基酸残基彼此相连；所谓的异 型的多聚泛素化修饰指的是，靶蛋白泛素链上的泛素分子之间存在多种类型的氨基酸残基之 间的相互连接的状态.
（2）泛素化过程通常由泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）介导。在泛 素-蛋白酶体系统中含有多个关键的组分，包括：泛素、泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、 泛素蛋白连接酶（E3）、去泛素化酶（DUB）和蛋白酶体。
（3）整个泛素化过程，可以被描述为 6 个步骤：
第一步：E1 酶激活泛素分子，此过程需要消耗 ATP，同时形成 E1-泛素的中间产物；
第二步：泛素分子从 E1 上，被转移到 E2 酶上，形成一个 E2-泛素的中间产物；
第三步：E3 酶先识别待降解的靶蛋白，然后 E3 酶再识别 E2-泛素中间产物，从而形成一个 包含 E2-泛素中间产物，E3 酶和靶蛋白的复合物。同时，E3 介导泛素标记物从 E2 酶转移到 靶蛋白上；
第四步：E2 酶和 E3 酶，从上述的复合物中释放，从而形成被泛素标记的靶蛋白；
第五步：重复上述过程，直到蛋白质上连接的多个泛素形成一条泛素链；
第六步：被泛素化的靶蛋白，被 26S 蛋白酶体识别并降解成小片段。
在整个泛素化过程中，泛素蛋白连接酶 E3 是最关键的分子，它有多重作用：1）E3 能特异 性地识别并结合底物靶蛋白；2）E3 介导了泛素从 E2-泛素中间产物转移到底物靶蛋白上的 整个过程。因此，E3 是泛素化过程中最关键的酶