转录组测序自问世以来，在研究基因表达、转录本结构、基因融合、非编码RNA鉴定等方面发挥了重要的作用。在有参考基因组的转录组数据分析的过程中，序列比对是一个重要的分析步骤，Hisat2 是目前常用的一款转录组数据比对软件，具有比对速度快，节省资源，比对算法优良的特点。本文将系统的介绍一下Hisat2这款软件。
一、Hisat2简介
Hisat2是一款短序列比对的工具，主要用于转录组数据的比对，是Hisat比对工具的升级版。Hisat2优化了索引建立的策略，采用了新的比对策略，使其与Bowtie/TopHat2等软件相比具有更高的敏感性和更快的运算速度。Hisat2的官方网址是：http://daehwankimlab.github.io/hisat2/，大家可以查阅详细信息。
二、Hisat2的下载与安装
Hisat2的安装方法比较多，下面介绍两种常用的方法，第一种方法是通过conda安装，命令如下：
$ conda install -c bioconda hisat2 ##conda 安装命令
第二种方法是从官网下载安装包并安装，以2.2.1.0版本为例，命令如下：
$ wget ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/downloads/hisat2-2.1.0-Linux_x86_64.zip ##软件下载
unzip hisat2-2.1.0-beta-Linux_x86_64.zip ##文件解压
为了方便使用，可以通过如下命令修改用户的环境变量。
$ vim ~/.bashrc ##以下为修改环境变量
$ export PATH=/User/your_path:$PATH
$ source ~/.bashrc
三、Hisat2的使用
1.索引的建立
在使用Hisat2软件进行比对之前，需要获得参考基因组的index文件。该文件有两种获取方式，第一种方法是在官网上进行下载，目前官网提供人类、小鼠、褐家鼠、黑腹果蝇、线虫、酿酒酵母这六个物种的index文件。此外有些物种还会提供不同数据库来源或者多个基因组版本的信息，如人类基因组会提供hg38、hg19等多个版本的信息，对于模式物种的使用来说是个比较方便的方法。下载链接为：
http://daehwankimlab.github.io/hisat2/download/。
第二种方法是自己构建index，这是适合非模式物种的一种方式，也是比较推荐的一种方法。以genome.fa作为参考基因组为例，具体方法如下：
$ hisat2-build genome.fa genome.fa ##参考基因组的索引建立
可添加参数说明：
-p 线程数，根据计算机和参考基因组情况进行修改；
--large-index，4G以上的基因组推荐加上这个参数；
index建立完成后，会生成8个ht2结尾的文件，示例如下：
2.序列比对
在参考基因组的index完成之后，就可以对样品的测序数据进行比对了。Hisat2的输出文件格式是sam格式，sam文件占用存储较大，可以通过管道符和samtools 工具，将sam文件转换为bam文件，并对bam文件进行处理，如排序、去重等。具体命令如下：
$ hisat2 -p 8 --dta-cufflinks -x ./hisat2-2.0.6_index/genome.fa -1 R1.fastq.gz -2 R2.fastq.gz --no-unal --un-conc |samtools view -Sb > test.bam ##hisat2比对
3.常用参数说明
Hisat2 参数较多，熟悉常用的参数可以帮助我们选择合适的参数进行分析和调整，常用的参数说明如下：
-x 参考基因组索引文件的前缀
-1 reads1，可以是压缩格式.gz .bz2
-2 reads2
-S 输出文件名（sam文件）
-P 线程数
-t 打印加载索引文件和对齐读取所需的时间
--dta-cufflinks 出来的结果更适合cufflinks处理 （主要用于基因表达量的计算和差异表达基因的寻找）
--no-unal 不记录没比对上的reads
--un-conc 在输出文件写出与参考基因组不一致的reads对
四、结果解读
1.输出日志
比对结束之后，Hisat2会输出日志文件，结果示例如下：
该文件会给出数据的整体比对率，唯一比对率，多重比对等信息。根据该文件我们可以判断基因组的选择或者数据是否有问题。
2.比对结果bam文件
使用Hisat2软件进行比对之后生成的默认文件是sam文件格式，bam文件是sam文件的二进制格式，可以减小文件的存储。了解sam/bam文件的格式对后续的分析结果的筛选非常重要，sam/bam文件的格式示例如下：
bam/sam文件的说明如下：
第1列：reads名称；
第2列：Flag标签；Flag标签是二进制数字之和，不同数字代表了不同的意义。比如下面的数据代表的含义如下：
1：代表这个序列采用的是PE双端测序；
2：代表这个序列和参考序列完全匹配，没有插入缺失；
4：代表这个序列没有比对到参考序列上；
8：代表这个序列的另一端序列没有比对到参考序列上，比如这条序列是R1,它对应的R2端序列没有比对到参考序列上；
16：代表这个序列比对到参考序列的负链上；
32：代表这个序列对应的另一端序列比对到参考序列的负链上；
64：代表这个序列是R1端序列，read1；
128：代表这个序列是R2端序列，read2；
256：代表这个序列不是主要的比对，一条序列可能比对到参考序列的多个位置，只有一个是首要的比对位置，其他都是次要的。
第3列：比对到的染色体信息；
第4列：比对到参考基因组物理位置；
第5列：比对质量值（0-60）；
第6列：CIAGR（记录插入、缺失等）；CIAGR中包含的是比对结果信息，表明了一条reads所有碱基的比对情况。比如CIGAR = 150M表示150bp的reads都比对到参考基因组上；常见的CIAGR标签表示的含义如下：
第7列：配对reads比对到的染色体，=表示相同；
第8列：配对reads比对到的染色体物理位置；
第9列：文库插入序列大小；
第10列：Reads序列；
第11列：质量值。
bam/sam文件的详细信息可以参见网址：
http://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf
参考文献
Kim, D., Paggi, J.M., Park, C.et al. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype.Nat Biotechnol 37, 907–915 (2019). https://doi.org/10.1038/s41587-019-0201-4
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