2022-07-28

Cancer Discov | 8万个单细胞测序揭示肿瘤浸润淋巴细胞分化动态

原创 huacishu 图灵基因 2022-07-28 11:47 发表于江苏

收录于合集#前沿生物大数据分析

撰文：huacishu

IF=38.272

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

1、作者分析了来自57个PDAC、22个正常样本的80000个T细胞，并使用单细胞转录组学和T细胞受体分析培养TIL；

2、这些数据为理解PDAC TIL的前景提供了一个框架，为未来TIL在PDAC免疫治疗中使用提供依据。

得克萨斯大学安德森癌症中心Chantale Bernatchez教授课题组在国际知名期刊Cancer Discov在线发表题为“Single cell sequencing reveals trajectory of tumor-infiltrating lymphocyte states in pancreatic cancer ”的论文。胰腺导管腺癌（PDAC）的有效治疗方法很少。免疫治疗是一种有吸引力的替代策略，由于缺乏对PDAC中肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的了解，这种疗法仍然具有挑战性。为了获得T细胞亚群的参考，作者分析了来自57个PDAC、22个正常样本的80000个T细胞，并使用单细胞转录组学和T细胞受体分析培养TIL。这些数据揭示了20种细胞状态和TIL种群的异质分布。CD8+TIL包含基于TCR克隆型共享的假定过渡GZMK+群体，细胞状态轨迹分析显示与GZMB+PRF1+细胞毒性和CXCL13+功能障碍群体相似。统计分析表明，某些TIL状态，例如功能失调和抑制性种群，经常同时发生。最后，对培养的TIL的分析表明，来自效应种群的高频克隆优先扩增。这些数据为理解PDAC TIL的前景提供了一个框架，为未来TIL在PDAC免疫治疗中使用提供依据。

胰腺导管腺癌（PDAC）约占所有胰腺癌的85%，5年生存率仅为9%，是美国第四大癌症相关死亡原因。化疗和手术仍是主要的治疗选择，然而，只有10-20%的患者有资格接受手术，其中80%的患者会复发。该患者群体未满足的临床需求促使人们努力扩大治疗选择。免疫治疗代表了一种令人振奋的新治疗策略，部分原因是免疫检查点阻断在黑色素瘤、肺癌和肾细胞癌中取得了成功。细胞免疫疗法也取得了成功。其中包括过继转移经工程处理的T细胞，以在几种血液肿瘤中表达嵌合抗原受体（CAR-T），以及转移性黑色素瘤中的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）。然而，迄今为止，免疫检查点阻断和CAR-T在PDAC中治疗效果有限。由于癌症患者对免疫治疗的反应不同，了解与临床反应相关的肿瘤微环境（TME）的潜在免疫景观非常重要。虽然TIL的存在与多种癌症（包括PDAC）的预后相关，但调节性T细胞（Treg）的抑制或进入功能失调状态而减弱细胞毒性功能已被确定为肿瘤免疫逃逸的机制。相反，TIL群体，如T-干细胞样记忆和组织驻留记忆样T细胞（TRM），已被确定为对反应或提高生存率很重要。这些群体通常由表面标记和转录状态的复杂组合来定义，目前还没有出现与结果相关的一致信号。鉴于肿瘤部位T细胞克隆的扩增可以表明免疫反应，并且高频克隆已被发现为肿瘤反应性克隆，因此T细胞库分析也可以提供TME中抗肿瘤反应的见解。单细胞RNA测序（scRNA-seq）已成为一种强有力的工具，通过结合同一细胞中的转录组学图谱和T细胞受体（TCR）序列来研究复杂细胞群（如TIL）的异质性。事实上，一些scRNA-seq研究揭示了多种实体瘤类型的TIL多样性，确定了T细胞功能障碍的各种状态以及与反应和预后相关的潜在新TIL群体。尽管存在肿瘤反应性TIL，但迄今为止PDAC对免疫治疗缺乏反应，并且迫切需要改进治疗方案，这使得PDAC成为使用scRNA-seq进行更深入分析的理想候选者。作者前期研究表明，肿瘤反应性PDAC TIL体外扩增用于过继细胞治疗（ACT）的可行性。因此，本研究的目的是表征PDAC TIL景观，以期为TIL在PDAC细胞免疫治疗中的应用提供信息。为了进行这项研究，使用单细胞RNA和TCR测序相结合的方法对PDAC患者新切除的肿瘤和正常组织进行分析，以考察存在的异质TIL群体，以更好地了解肿瘤浸润性T细胞。此外，使用类似方法分析来自肿瘤样本子集的培养PDAC TIL，以研究每个初始TIL群体对最终TIL产物组成的贡献，并考虑其治疗潜力。总的来说，根据转录组学和TCR数据，阐明了新鲜组织中的7种CD8+TIL细胞状态和5种CD4+TIL细胞状态。此外，体外扩增的TIL产物的转录组学和TCR分析显示，最初在原位识别的选择性效应T细胞状态优先扩增。

单个T细胞转录组数据的生成和处理

为了描述PDAC中的TIL状态，对七个主要的人类PDAC样本和一个正常的胰腺样本进行了scRNA-seq（图1A）。总共分析了57个PDAC样本和22个正常样本中的39694个T细胞。来自所有样本的T细胞聚类共识别出13个群体，包括五种CD4+TIL细胞状态（CD4-FOXP3、CD4-CXCR4、CD4-CCR7、CD4-CXCL13、CD4-MX1）、七种CD8+TIL细胞状态（CD8-GZMK、CD8-CXCR6/IL7R、CD8-ZNF683、CD8-GZMB/PRF1、CD8-CXCL13、CD8-CCR7/IL7R、CD8-MX1）和一个循环亚群体（图1B）。在确定在该细胞状态中表达的定义T细胞基因后，对这些细胞状态进行注释。使用RNA原位杂交（RNAScope）在福尔马林固定石蜡包埋的原发性PDAC组织中验证了除CD8-CXCR6/IL7R外的所有CD4+和CD8+TIL细胞状态的存在，该方法能够在单个细胞中显示单个RNA分子。为了了解每个T细胞簇的生物学功能，作者研究了差异表达基因以及特定已知转录因子的表达。该分析揭示了关键基因的簇特异性表达，表明簇之间的细胞状态编程差异（图1C）。虽然TIL细胞状态主要由αβT细胞组成，以TCRα链基因TRAC的表达为标志，但发现γδT细胞是CD8-GZMB/PRF1细胞状态的一小部分。除了转录状态外，还有一种独特的循环T细胞状态，表达MKI67和其他细胞周期相关基因（图1B）。关于TIL状态的潜在功能特性，由于FOXP3、IL2RA（CD25）、CTLA4和Treg相关转录因子IKZF2（Helios）和IKZF4（Ikaros；图1C）的表达，CD4-FOXP3簇被归类为Treg。根据CD69、GZMA和CCL5的表达，还确定了活化的CD4+辅助性T细胞群CD4-CXCR4。然而，转录因子TBX21（TBET）和GATA3的低表达使得1型或2型辅助性T细胞的分类不明确（图1C）。如前所述，在CD8 TIL群体中，CD8-ZNF683簇似乎是TRM转录因子ZNF683、TRM相关基因XCL1和GNLY的表达以及KLF2的低表达所表明的TRM样群体（图1C）。此外，通过特征良好的效应细胞标记物GZMB和PRF1以及转录因子TBX21的高表达，确定了细胞毒性CD8+细胞状态（CD8-GZMB/PRF1）（图1C）。

在整个队列中，以不同的频率检测到T细胞状态（图1D）。此外，正常样本主要聚集在远离PDAC样本的地方，表明其T细胞簇组成存在整体差异（图1D）。与PDAC样本相比，正常组织中的CD8-CXCR6/IL7R细胞状态显著富集，而在CD8-ZNF683细胞状态中则相反。此外，为了确定细胞状态是否为肿瘤组织特异性或反映肿瘤起源器官，在匹配肿瘤和正常组织样本的10名患者子集中比较了细胞状态组成（图1E）。在这些患者中，发现CD4-FOXP3和CD4-CXCR4细胞状态在正常组织中富集，而CD8-CXCR6/IL7R和CD8-GZMB/PRF1细胞状态在正常组织中富集。然而，在多次测试的P值校正后，这些变化在统计学上并不显著。

轨迹映射揭示的TIL转录组状态的转变

由于CD4+和CD8+T细胞没有发育相关性，因此分别对这些主要亚群进行轨迹分析（图2A和2B）。此外，由于T细胞发育景观的高度复杂性，图上显示的线由每个节点周围的细胞密度加权。该密度与支持该点轨迹的数据量成正比，因此与图中该位置的置信度成正比。对于CD8+TIL，推断CD8-CCR7/IL7R TCM状态和CD8-CXCR6/IL7R状态在轨迹中相关。然而，图中该部分的细胞密度支持度较低，表明其他CD8+TIL状态并非完全来自于在肿瘤中检测到的TCM群体（图2A）。轨迹还表明，CD8-GZMK可能是介于CD8-GZMB/PRF1细胞毒性细胞状态和CD8-CXCL13潜在功能障碍状态之间的中间细胞状态。从这些轨迹上看，CD8-MX1 IFN-I反应细胞状态与其他细胞状态的关系似乎不清楚，因为它们没有出现在轨迹的一个分支上，这表明它们可能是一种单独的状态。此外，除CD8-CXCR6/IL7R外，来自肿瘤和正常样本的CD8+TIL重叠（图2C）。轨迹分析表明，一小部分效应细胞可能与CD4-CXCL13功能障碍簇有关。然而，这部分轨迹的细胞数量相对较少，其转录数据支持了这种转变。同样，CD4+T细胞轨迹也预测了从效应器状态到最终Treg表型的转变。这可能表明这些是浸润肿瘤的天然Treg，而不是从另一种原位状态转化的诱导Treg。与CD8-MX1 IFN-I簇类似，CD4-MX1 IFN-I应答群与其他簇之间的关系尚不清楚，可能是由于其样本量小的原因。与CD8+TIL不同，肿瘤和正常人之间的CD4+TIL群体具有同质性（图2D）。为了确定同一PDAC样本中T细胞状态共存的程度，以患者为单位对所有肿瘤样本的细胞状态频率进行了相关性分析。两种细胞状态之间的显著正相关表明，如果患者的簇“A”比例较高，则他们的簇“B”比例也往往较高（图2E）。该分析表明，高度相关的CD8-MX1和CD4-MX1 IFN-I应答细胞状态的频率彼此显著相关。最后，CD8-CXCL13和CD4-CXCL13细胞状态彼此显著相关，此外还观察到CD8-CXCL13细胞状态与细胞循环群之间的显著相关性，表明CXCL13细胞状态可能是TIL的增殖群（图2E）。通常，功能失调（CXCL13）、干扰素反应（MX-1）和抑制（FOXP3）细胞状态从效应器（ZNF683、GZMK、GZMB/PRF1）或分化较低的细胞状态（CCR7/IL7R）聚集（图2E）。

TCR克隆型分布显示扩展的TIL克隆可以占据多个细胞状态

为了进一步了解T细胞状态的潜在功能以及它们之间的关系，在七个样本的子集上对同一细胞进行单细胞TCR测序和转录组分析。鉴于数据集之间的重叠程度，MDA1队列可与组合数据集进行比较。通过量化MDA1数据集和较大数据集之间的基因重叠，进一步验证了相似性（图3A）。除CD4-CXCL13细胞状态仅由MDA1队列中的少数细胞组成外，每个细胞状态至少有70%的顶部基因重叠。此外，MDA1 TIL的无监督聚类显示，该子集中的细胞状态标记与较大的数据集相似。例如，CD8+细胞状态的顶级标记包括GZMK、IL7R、ZNF683、PRF1、CXCL13和MX1，而CD4+TIL细胞状态的顶级标记包括FOXP3、CD40LG、SELL、CXCL13和MX1。较小MDA1队列的UMAP嵌入表明聚类的稳健性，原始细胞状态标签在CD8+和CD4+TIL的UMAP投影中保留共定位（图3B和3C）。为了评估MDA1样本集中采样偏差的可能性，分析了每个样本对不同细胞状态的贡献（图3D和3E）。除了主要来自一个样本（MDA1_T05）的CD8-CXCL13细胞状态外，细胞状态并非由单个患者主导（图3D）。总之，这些数据表明，从较小的MDA1队列得出的结论可能扩展到更大的PDAC患者数据集。

因为在多个细胞状态中发现的克隆型可能表明这些状态之间的转换，所以接下来分析来自同一单个细胞的TCR序列和转录组信息，以确定细胞状态之间的关系。CD8+TIL和CD4+TIL的转录细胞状态及其克隆频率的组合显示，大多数克隆在低频率下检测到，表明肿瘤部位的增殖有限（图4A和4B）。聚焦于图4A中的CD8转录组状态，作者发现在CD8-GZMK细胞状态中扩增的TIL克隆型具有高度的细胞状态共享（图4A），圆形克隆型图的放大部分突出显示了扩展克隆（图4C）和未扩展克隆（图4C）之间的对比。upset plot进一步强调了这些观察结果，该图显示了细胞状态共享的数量和检测到特定交叉点的次数（图4D）。此外，CD8-ZNF683细胞状态还表现出许多扩展的克隆型（图4A）和大量的细胞状态共享（图4D），其41个克隆型中的23个在至少一个其他细胞状态中检测到，特别是CD8-CXCR6/IL7R状态。CD8-GZMK和CD8-ZNF683簇也表现出与CD8-GZMB/PRF1细胞状态的共享。相反，CD8-CXCL13细胞状态下的克隆高度扩增（图4A），但在其他细胞状态下仅检测到一次，可能表明轨迹上的终止点（图4D）。在CD4+TIL中，仅发现非常有限的簇共享，表明肿瘤中缺乏增殖（图4B，4E）。

克隆扩增发生在CD8+TIL细胞状态，而不是CD4细胞状态

为了量化每个簇内克隆扩展的程度，通过计算患者CD4+和CD8+TIL的Gini指数来测量克隆频率均匀性（图5A）。Gini系数是不平等的度量，范围从0到1，其中较低的值表示克隆频率均匀性。我们观察到，总体而言，CD8+TIL的多样性低于CD4+TIL。基于Chiffelle等人之前对T细胞库指标的分析，作者得出结论，与CD4+TIL库相比，CD8+TIL库的扩增部分包含更多克隆。当按细胞状态分解T细胞库时，观察到一种类似的模式，即所有CD4+TIL状态表现出比大多数CD8+TIL状态更低的克隆性（图5B）。对CD8+TIL高克隆性贡献最大的是CD8-GZMK、CD8-GZMB/PRF1和CD8-CXCL13细胞状态。总之，这表明在这些细胞状态下选择性TIL克隆的扩展。图5C进一步说明了克隆扩增的程度以及每个细胞状态下CD4+和CD8+库之间的差异。CD8-GZMK、CD8-ZNF683、CD8-GZMB/PRF1和CD8-CXCL13在TME内克隆扩增的细胞比例最大。这与CD8-CXCR6/IL7R细胞状态形成对比（图5C）。与先前关于TCR序列克隆性和多样性的发现一致，CD4+细胞状态呈现少数克隆扩增的TIL，这可以通过在这些细胞状态中发现的大多数克隆只检测一次来证明（图5C）。综上所述，这些指标表明，尽管CD8+TIL群体的克隆型丰富度与CD4+TIL相似，但CD8+效应物群体更具克隆性，表明部分TIL克隆参与了对肿瘤的免疫反应。

TIL转录组分析和TCR测序揭示了它们在体外繁殖后的命运

同时，当处理来自MDA1队列的组织样本以获取scRNA-seq时，每个组织中的一部分用于体外TIL生长。然后将培养的TIL用于转录组和TCR-scRNA序列（图6A）。TIL表达数据揭示了七种主要细胞状态，包括五种CD8+状态（G1-CD8-CD27、G2-CD8-GNLY、G3-CD8-ZNF683、G4-CD8-CCL3、G4-CD8-MKI67）、一种CD4+状态（G6-CD4-CD40L）和一种γδ+T细胞状态（G7-γδk-TRDC；图6B）。正如所料，大部分培养的TIL是循环细胞。特征基因的表达表明有几种激活的CD8+细胞状态、增殖的CD8+状态、效应CD4+状态和γδ+T细胞状态（图6C）。基于细胞的癌症免疫治疗领域的一个主要目标是识别和选择最佳的T细胞亚型，以提供最有效的过继细胞治疗。为此，作者试图辨别图1中确定的不同新鲜TIL细胞状态的命运，以确定TIL培养过程是否扩展了感兴趣的亚群。单个TCR用于跟踪从新鲜样品到相应生长的TIL产物的TIL。作者发现，无论其在组织中的初始转录组细胞状态如何，TIL克隆型均在多种生长细胞状态下鉴定，培养产物中大多数为G1-CD8-CD27亚型（图6D）。对生长的TIL与其转录组簇配对的TCR频率的分析表明，簇共享程度很高，在多个转录组簇中发现相同的TCR序列。尽管任何最终生长的细胞状态与特定的初始PDAC TIL群体之间缺乏联系，但有迹象表明，组织中的某些TIL群体优先于其他群体生长（图6E和6F）。来自CD8-GZMK、CD8-ZNF683和CD8-GZMB/PRF1簇的T细胞克隆优先在体外扩增，而来自CD8-CXCL13群体的T细胞克隆的频率相对于其在组织中的初始频率降低（图6E）。CD4+TIL表现出类似的模式，其中主要是CD4+效应细胞扩张，而Treg没有（图6F）。数据表明，在新鲜组织中检测到的高频克隆被扩增，并且它们在生长产物中保持相对较高的频率。

小结

本研究使用scRNA-seq研究CD8+和CD4+T细胞，并定义了PDAC和正常胰腺组织样本中的13种细胞状态，以及体外培养产生的7种细胞状态。这项研究使用了在癌症中心治疗的7名患者的初始队列，然后通过添加来自癌症中心的26名患者的另一队列以及来自北京协和医院先前研究的24名患者的队列来进一步加强。基于所有三个队列的转录数据，以及最初七个患者队列中的并发单细胞TCR测序，作者提出了PDAC TIL的组织关系和分化轨迹以及它们在体外培养的每个组成群体中的无限制扩展的模型。本研究中检测到的TIL细胞状态与其他癌症类型文献中报告的状态一致，并验证了本研究中使用的三个数据集缺乏样本量偏差。例如，在黑色素瘤、三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌和肝癌的其他scRNA-seq研究中报告了与此处发现的CD8-GZMK、CD8-ZNF683和CD8-CXCL13相似的CD8+TIL群体。总之，本研究确定了PDAC患者的TIL细胞状态、推断的原位分化轨迹以及在体外TIL培养过程中的命运，以应用于TIL ACT。虽然本文的观察结果与其他癌症类型一致，但值得注意的是，本文的结论是基于一个动态过程。需要在免疫治疗的PDAC患者中进行纵向联合转录组和T细胞库分析的未来研究，以更好地了解此处介绍的TIL细胞状态及其对这种癌症类型的临床意义。最后，期望从这些数据中获得的知识将有助于为未来的T细胞靶向治疗策略以及基于TIL的策略的提供信息。

教授介绍

Chantale Bernatchez教授就职于得克萨斯大学安德森癌症中心。她专注于癌症研究的四个关键领域：基础科学、转化研究、临床研究和预防以及个性化风险评估。1）基础科学：基础科学研究的目标是了解健康细胞中的正常生物过程，并揭示这些过程在癌症中如何发生故障；2）转化研究：随着基础研究推动了许多发现，Chantale Bernatchez教授致力于将最好的科学转移到临床。通过验证在动物模型和体外研究中发现的东西，并观察相同的过程是否适用于人类，从而迈出了第一步；3）临床研究：MD Anderson是肿瘤学介入临床试验最大项目之一的所在地。无论是早期检测和治疗、个性化药物还是免疫治疗，临床研究都是将发现带到终点的关键；4）预防和个性化风险评估：预防是消除癌症使命的关键支柱。了解如何通过预防和个性化风险评估计划让社区参与研究、教育和临床护理至关重要。

参考文献

Schalck A, Sakellariou-Thompson D, Forget MA, et al. Single cell sequencing reveals trajectory of tumor-infiltrating lymphocyte states in pancreatic cancer. Cancer Discov. 2022;CD-21-1248. doi:10.1158/2159-8290.CD-21-1248