乳腺癌是当前影响女性生命健康最重要的一种癌症，根据神刊CA杂志发布的2018年癌症统计报告，在过去的一年中，新增的女性癌症患者大约有860万，其中有24.2%为乳腺癌；因为癌症死亡的女性有420万，其中乳腺癌患者占据15%。由此可见，乳腺癌是众多癌症中新增病例最多，死亡率最高的癌症。
虽然乳腺癌已经严重威胁到女性的生命健康，但是目前能有效治疗乳腺癌的药物并不多，其中最主要的原因是缺乏靶点以及病人异质性导致的治疗抵抗。
根据乳腺癌细胞表面三种重要分子（分别为雌激素受体ER、孕激素受体PR和人表皮生长因子受体2 HER2）的表达情况，可以大致将乳腺癌分为3大类，分别为雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌、人表皮生长因子受体2阳性（HER2+）乳腺癌和三阴性乳腺癌。
今天分享的这篇Nature文章是一项在乳腺癌治疗领域取得重大突破的研究，然而，就是这样一项让人兴奋不已的研究成果却是来源于一场意外，下面我们一起来见证这场美丽的意外吧。
这篇文章于2019年4月17日发表在Nature杂志上，通讯作者是哈佛大学医学院的Senthil K. Muthuswamy教授和丹娜-法伯癌症研究所的Myles Brown教授。
在这篇文章中，作者发现ER+的乳腺癌中LLGL2能通过提高亮氨酸摄取来缓解营养压力。
研究背景：ER+乳腺癌占据女性乳腺癌患者总数的65%-75%，具有较高的发病率，目前针对这种癌症的主要治疗手段是内分泌治疗，其主要的策略就是靶向ER的抑制剂或者是能够与雌激素竞争性结合ER的激素类似物。
临床上应用较多的药物是他莫昔芬，它就是一种雌激素类似物，但是很多乳腺癌患者对他莫昔芬不敏感，其中的机制目前还不清楚，如何提高他莫昔芬的敏感性也一直是研究的重点和难点。
LLGL2是果蝇中LGL蛋白的类似物，在果蝇中它作为一种肿瘤抑制因子，能够抑制肿瘤生长，但是在哺乳动物中LLGL2是否影响肿瘤的发生发展目前还不清楚，本文就对这个问题进行探究。
为了探究LLGL2对乳腺癌发生的影响，作者检测了不同类型乳腺癌细胞中LLGL2的表达，发现在ER+乳腺啊癌中，LLGL2高表达，并且通过KM plot生存分析也揭示高表达LLGL2的病人，其生存率降低，这暗示LLGL2促进乳腺癌发生。并且通过免疫组化等试验验证了这一点。
为了确定这个结果，作者在乳腺癌细胞中过表达LLGL2，发现在正常培养基中，细胞的增殖无明显变化（想想此时，作者估计已经泪奔）。
正常培养基
作者发现在血清饥饿的情况下，过表达LLGL2明显促进了细胞的增殖，这暗示血清对LLGL2功能的发挥至关重要。
血清饥饿培养基
当我看到这里的时候，我就在想，作者是怎么想到这点的，后面查了一下，作者是在一次偶然的实验中，作者忘了在培养基中加入血清（我也曾经忘了加血清，悲剧的是我没有收到意外结果，却收到了导师的臭骂），却意外的发现了这一现象。
按照功能基因的基本研究套路，有过表达，就有敲低，作者RNAi敲低LLGL2，发现在无血清培养基中，敲低LLGL2能够抑制肿瘤细胞的增殖。
与过表达一样，敲低LLGL2，在有血清情况下，细胞的增殖不受影响。而无血清培养条件下，增殖受到抑制。
作者rescue实验进一步证实LLGL2的作用。
上面这些都是在细胞水平上的实验，作者在动物水平上也进行了验证。
然而，LLGL2促进增殖是因为无血清条件下诱导的还是LLGL2本身具有调节细胞增殖的能力，需要进一步的验证。敲除LLGL2并不影响细胞的存活，因此LLGL2是细胞增殖的调节因子，而不是在无血清条件下细胞自身血清饥饿诱导产生的抑制作用。
接下来作者探究血清中究竟何种因子调控LLGL2对肿瘤细胞生长的促进作用。作者将血清过滤掉氨基酸和其他低分子营养物质，但保留了生长因子。10%透析胎牛血清lgl2- kd细胞增殖受损。表明lgl2基因的下调，细胞的增殖依赖血清中低分子营养物质。
讲到这里，有一个问题，在有血清条件下，无论是过表达还是敲低，细胞增殖都不受影响。在无血清条件下，过表达LLGL2促进增殖，而敲低，抑制增殖。按照敲低LLGL2，细胞在没有低分子营养物质培养基中增殖受到抑制，说明细胞的增殖依赖血清中低分子营养物质，但在无血清条件下，过表达LLGL2促进增殖，这里的培养基中可没有低分子营养物质，LLGL2又是怎样促进增殖的？？
作者通过代谢组学的分析，在LLGL2-KD与对照组MCF-7细胞之间差异显著的前50个代谢物中，对照组中必需氨基酸含量较高，LLGL2-KD细胞中必需氨基酸含量低于对照组。
在9种必需氨基酸中，LLGL2-KD细胞的亮氨酸、异亮氨酸和色氨酸均低于对照细胞，无论是在培养细胞中还是在体内肿瘤细胞中都不同程度地降低了LLGL2-KD细胞中的亮氨酸、异亮氨酸和色氨酸。作者也就发现血清中的这些氨酸在其中起着至关重要的作用。
作者测试了在营养胁迫下，补充过量的极限氨基酸是否可以挽救生长。结果发现只有过量的Leu才能挽救LLGL2- kd细胞的增殖，说明LLGL2通过促进Leu的摄取来支持细胞增殖。
与LLGL2-KD细胞相比，对照组细胞对过量的Leu和Gln不敏感，排除了非特异性作用。
过表达的LLGL2 (LLGL2- oe)足以促进细胞在LQ压力培养基（one-tenth the normal concentration of Leu and Gln）中的增殖。表明LLGL2过表达足以使细胞适应LQ胁迫。这也就解释了前面提出的那个问题！在正常培养基中，LLGL2正常表达或过表达时对过量的氨基酸不敏感。
而超过10倍的Leu和Gln增强了LLGL2-OE MCF-7细胞的生长，但没有增强对照组细胞的生长，从而确定了细胞LLGL2水平与LQ调控的细胞增殖之间的定量关系。
进一步研究发现，与亲代细胞或LLGL2-OE细胞相比，LLGL2-KD细胞对细胞外亮氨酸的消耗效果较差。表明LLGL2的细胞内水平影响亮氨酸的消耗。
接下来作者探究LLGL2促进亮氨酸摄取的机制，由于LLGL2并没有氨基酸转运能力，这表明这个过程可能需要其他蛋白的介导。在10×LQ培养基中，LLGL2-OE或LLGL2-KD细胞的细胞内Leu均呈上升趋势或明显升高;然而，其他氨基酸的水平呈现出不同的模式。
由于没有细胞极性蛋白影响Leu摄取的先例，并且认识到LLGL2是支架蛋白，我们在极化和生理条件下进行了proximity-dependent biotinylation(BioID)分析。与野生型的LLGL2类似，标记生物素连接酶(BirA*)融合的LLGL2保留了在营养胁迫下促进MCF-7细胞增殖的能力。
通过质谱检测，作者发现LLGL2能与SLC7A5和YKT6结合形成三聚体，从而将SLC7A5锚定在细胞膜上，SLC7A5是一种氨基酸转运体。并且在5种SLC蛋白中，SLC7A5的相互作用最强。
然后作者进一步分析发现，在ER + / PR +乳腺癌患者中，高水平的SLC7A5 mRNA与与患者临床预后不良相关。
共免疫沉淀分析表明，在营养胁迫条件下，LLGL2与SLC7A5和SLC1A5相互作用。此外，SLC7A5和LLGL2在细胞连接处共定位，进一步证实了LLGL2与SLC7A5相互作用促进细胞在营养胁迫下增殖的假设。
与在氨基酸转运中的作用一致的是，与对照MCF-7细胞相比，LLGL2的敲除降低了mTOR途径靶点s6激酶的磷酸化，这表明LLGL2是氨基酸诱导的ER+乳腺癌细胞mTOR活化的调节器。
在MCF-7或T47D细胞中敲除SLC7A5（SLC7A5-KD）可在粘附和非粘附条件下损害细胞增殖，rescue实验进一步验证这一结论。
与对照组MCF-7细胞不同，原位移植SLC7A5-KD细胞不形成肿瘤。
此外，亲代MCF-7肿瘤在使用选择性抑制SLC7A5的JPH203治疗后显著消退。
SLC7A5的过表达足以支持细胞在营养胁迫下的增殖。
总之，这些证据证明了SLC7A5是ER+肿瘤细胞在培养和体内增殖的关键调控因子。
虽然SLC7A5的总蛋白水平不受影响，LLGL2-KD细胞、SLC7A5在细胞间连接中丢失。
根据表面蛋白的生物素标记，LLGL2-KD细胞中SLC7A5的细胞表面水平(而不是E-cadherin)明显低于Control组或Rescue组。
乳腺癌组织免疫组化染色证实膜定位SLC7A5在llgl2高ER+肿瘤中表达，而在llgl2低ER -肿瘤中不表达。
与LLGL2相比，乳腺癌细胞中SLC7A5的总表达量不随ER状态而变化。ER+细胞的生长，而不是ER -细胞的生长，在 2-aminobicyclo-(2,2,1)-heptane-2-carboxylic acid(BCH，选择性SLC7A5抑制剂，破坏亮氨酸转运)反应中明显受损。
ER -乳腺癌细胞表面SLC7A5水平低8倍。表明LLGL2与SLC7A5细胞表面水平之间的关系与ER+细胞有关。
尽管LLGL2和SLC7A5以及细胞表面SLC7A5之间的相互作用在养分充足的条件下可以检测到，但两者都是由养分胁迫诱导的，这表明细胞通过增加表面SLC7A5来适应养分胁迫。
值得注意的是，膜定位缺陷的llgl2多碱基（llgl-pb）突变体保留了与slc7a5相互作用的能力，但未能在营养胁迫下挽救llgl2-kd细胞的生长。
为了鉴定lgl2 - slc7a5复合物的其他成员，我们研究了YKT6的作用。内生YKT6在养分胁迫下与SLC7A5和LLGL2形成三聚体复合物。YKT6的敲除抑制了营养胁迫下细胞的增殖，并降低了SLC7A5的表面水平，抑制了LLGL2的菲可比性敲除。YKT6是LLGL2-SLC7A5途径的一部分，调节SLC7A5的表面水平和对营养胁迫的适应。
用雌激素(E2)刺激MCF-7和T47D细胞，诱导LLGL2表达增加。
我们研究了LLGL2是否是雌激素受体(ER)的靶点，是否参与E2诱导的细胞增殖。对照细胞和LLGL2-KD细胞均不能在缺乏雌激素活性的培养基中增殖。表明LLGL2是E2诱导细胞增殖所必需的。
E2刺激足以在LQ应激条件下恢复细胞增殖。值得注意的是，LLGL2基因的下调抑制了E2在营养胁迫下拯救细胞增殖的能力，表明e2诱导的细胞增殖依赖于LLGL2
LLGL2过表达促进E2诱导的MCF-7细胞增殖，提示LLGL2水平与E2调控的细胞增殖之间存在定量关系。
作者在受E2刺激的MCF-7(基因表达综合登录号GSM1534722)和E2/孕酮处理的T47D(GSM1669014)细胞和乳腺癌标本(GSE32222)的染色质免疫沉淀测序(CHIP-SEQ)数据中观察到一个与组蛋白H3乙酰化(H3K27ac；图4D)的开放染色质区域相一致的ER结合位点(ERE)，这表明LLGL2可能是ER介导的转录的直接靶点。为了验证LLGL2在营养胁迫条件下调控E2诱导增殖的特异性，我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术消除了LLGL2基因第2内含子523 bp的ERE。
E2刺激不能诱导LLGL2中缺少ERE位点的细胞表达LLGL2，但对照细胞没有影响，说明内含子2中的ERE是E2诱导LLGL2表达的重要介质。删除ERE而不是控制区可以阻断E2诱导的细胞增殖，表明E2介导的对营养胁迫的适应需要LLGL2的表达。
在接受三苯氧胺治疗的799例ER+乳腺癌患者中，LLGL2或SLC7A5的高表达与生存率低相关，表明LLGL2和SLC7A5可能与三苯氧胺抵抗有关。在三苯氧胺耐药（TAMR）MCF-7细胞中，SLC7A5的总蛋白和细胞表面水平显著上调，而LLGL2的水平没有任何显著变化。
总结这篇文章，作者意外的发现：在血清饥饿的情况下，雌激素能够与LLGL2基因的第二个内含子结合，促进LLGL2表达，后者在YKT6的协助下促进SLC7A5的膜定位，促进SLC7A5的亮氨酸的摄取，进而提高肿瘤生长，因此，SLC7A5和LLGL2可以作为ER+乳腺癌的治疗靶点。
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