基础知识——第一代测序技术---Sanger 法测序

测序发展过程

一、测序过程和原理

1.第一代测序技术---Sanger 法测序

• 创始人：Frederick Sanger Frederick Sanger

Sanger在胰岛素测序、RNA测序和DNA测序研究方面做出了重要贡献，并因此两次获得诺贝尔化学奖（1958和1980）。

• Sanger测序原理介绍：

首先，将待测的DNA扩增，复制出很多相同的DNA，准备足够多的样本量。 image 接下来，加热这些样本，使DNA变性。双链DNA分离开来，成为单链DNA，只保留3‘-5’的那一条单链，称之为模板链。 image 将测序引物和模板链结合，从模版链的3’端位置开始。加入引物是因为DNA聚合酶不能重头复制需要前面有一小段起点。 image 然后将添加完测序引物的DNA平均分散在四个反应容器中 image

接下来将DNA聚合酶，四个基本碱基的原料（dNTP）还有特异性的ddNTP分别加入这四个反应容器中，每个反应容器中只加入一种ddNTP。

特异性的ddNTP就是一种变异过的碱基，也有四种称之为A,T,C,G,这种特殊的碱基也可以和对应的碱基相结合，A-T,T-A,C-G,G-C。但是和普通碱基不同的是，当他们和对应碱基结合后，可以终止后续的其他结合，就是DNA的链式反应就结束了。这就产生很多一边完整（模板链），一边不完整（ddNTP存在的链）的DNA分子。 以黄色容器内的反应为例，黄色容器中加入了ddATP（A*）

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因为有DNA聚合酶，还有碱基原料，还有特殊碱基A*，在这个容器内开始了DNA聚合反应。

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聚合酶将各个碱基连到模板链上，直到特殊碱基结合到模板链上，聚合反应终止。由于结合是随机产生的，所以特殊碱基A* 会随机结合到某个T碱基上。

image 同理在其他三个容器中发生的反应与上面的反应类似，等到反应结束之后，将这四个容器中的产物放到电泳胶上。 image

由于其磷酸盐主链赋予的负电荷，DNA从负极开始迁移，较小较轻长度的DNA进一步迁移到电泳版的底部。

就是我们刚刚提到的，由于ddNTP随机结合的位置不同，形成的不完整DNA分子，这里不同的DNA分子就被区分开来了，并且分布在不同的位置上。

通过荧光标记的方法，就会在胶片上留下记号，最后从下往上读，就可以得到DNA的序列。 image

• Sanger测序特点：

①优点：方法简便，分辨率高，测序片段长，流程细致，质控环节多，污染低，结果直观可视，假性结果极低。

②缺点：测序试剂昂贵，通量低，处理比较长的同聚物时也有自身的问题，例如很难以高可信度将7个A和8个A区分开来。

• Sanger测序应用： 受限于通量低的特点，Sanger测序目前多用于少量DNA分子测序实验中。如我们常使用的对质粒、PCR产物、单基因突变进行序列分析。