测序101

不谈测序就讲入门生信就是耍流氓。

尽管你可能会说生信分析还包括组学分析，蛋白质分析，但小D认为生信的基础离不开测序技术，所以啊，小D公众号的第一讲就想给大家再梳理一遍测序技术的常识。

      测序技术迭代迅猛，在短短30年时间里已发展了3代半，第一代测序技术始于1977年Sanger测序，其基本原理是利用ddNTP的3‘端脱氧而阻断DNA合成的原理开展，也是靠它完成了2001年的首个人类基因组图谱。 ddNTP 是在3’C 上缺了羟基的dNTP，测序过程中以A通道为例，该通道会含有dATP ，以及缺羟基的ddATP ，在反应过程中，模板上每个A碱基的位置都有几率合成一个ddATP，因此而中断反应。 整个反应结束后，A通道里有不同长度的片段，它们都是被终止在了A碱基的位置， 其他通道亦然。后续，通过跑胶，得到每个通道片段长度，从而确定每一碱基位点该call 哪个碱基。

                                                                    (nationaldiagnostics.com) 

二代测序区别于一代测序最主要的点在于它的高通量，和成本低，片段小。 测序过程通常包括，DNA或者RNA的准备，DNA片段化（通过超声，酶切等方法）， DNA 小片段扩增建库，主要是通过PCR。接着就是测序，SBS（sequncing by synethsis),二代主打的边测序边反应技术是不同于一代测序的终止反应。二代测序的主要代表技术是Roche 454（已过时）， Illumina（大佬）的桥扩增，SOLiD（‘油包水’PCR扩增），华大基因买断美国CG公司的纳米球测序（球状DNA含有PCR复制的短序列），还有就是Ion Torrent（通过检测每个碱基合成时产生的电流来call碱基）。下图展示的是illumina 桥扩增技术。

                                                                    (bioinformaticsgroup.com)

到了第三代测序，又叫单分子测序，为了节约成本，开始了又一轮的的改进，例如，去掉PCR扩增，增长reads的读长，三代测序中代表有，PacBio, Helicos, Nanopore， 三代测序旨在实现DNA聚合酶的延续性，使得在一个反应内有上千个碱基得到合成。 下图(a)是PacBio的原理，DNA聚合酶和模板被固定，流体中是含有不同dye的碱基，通过合成时激发的荧光判定碱基。 图（b）则是nanopore 的展示，其技术的核心是一个通道只有单分子通过，通过时的电流变化被捕捉， 通过电流的变化来call碱基。

        三代虽好，但它的精确度还是有待提高。相比上一代，二代测序，其错误率是最高的，但确也是最有挖掘前景的。

                                                                （sciencedirect.com)

        回顾完了测序技术的发展，再来聊聊技术的更新换代对于行业内的影响。 从2003 年30亿美元的人类全基因组测序之后，随之而来的Illumina，  PicBio， Ion Torrent，等NGS技术使得测序成本十年之内大幅降低， 人类全基因组测序已从当年的30亿美金降至600美元，其速度已远超摩尔定律。那有小伙伴想问了现在是测序成本的平台期了呢？ 小D 的看法是，  二代测序从技术或成本很难再有质的突破了， 但很难预测三代，甚至四代测序会带来怎样的红海。越来越多的基因公司出现于人前，可见健康产业已为大众熟知。产前检测，癌症筛查，遗传病预防等，我们希望倾听我们的基因说什么...

        基因行业的发展将带来的是大量数据，这才是一个新的有待挖掘的领域，如何更快更好的从数据中发现隐藏信息，考验着每个生信人。做生信可不仅仅是跑流程， 搭建流程，挖掘数据才是每个生信人所应具备的基本素质。