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《现代分子生物学》-朱玉贤版-阅读笔记

《现代分子生物学》-朱玉贤版-阅读笔记

作者: 宇宙独一无二的我 | 来源:发表于2017-01-26 11:27 被阅读315次

    由于我本身是学计算机的,现在以及未来的研究方向主要是生物信息学。所以,仔细学习一下分子生物学很有必要,因为很多生物的实验原理以及生物学概念(转座子、增强子、顺式调控元件等等)在看论文的时候如果没接触过,很容易看的头大。因此本文面向的主要对象是计算机专业,研究生物信息等领域的初学者。

    废话不多说了,我阅读的教材是朱玉贤的第4版,由于是从阅读到中间开始记录的。部分没有记录的章节要点稍后补全。

    第五章 DNA、RNA、蛋白质操作技术

    第5、6章主要讲常用的实验技术,对明白生物相关的论文为什么要做某些实验,以及在要找相关的数据的时候,用哪种实验的数据都很有帮助。

    重组DNA技术

    重组DNA通常是通过将特定DNA片段整合到病毒或者质粒等载体上,构成重组DNA,通过侵染或者注入等形式进入宿主细胞。使得宿主细胞得以表达某些DNA,通常的目的有:合成蛋白质,研究某些DNA的功能等。

    重组DNA的必备原料有:

    • 限制性核酸内切酶:用来切割DNA分子。(EcoR I等)
    • DNA连接酶:连接DNA分子。
    • 载体:病毒,质粒等,具备自主复制能力,可以通过某些手段进入宿主细胞内,来在扩增自身的同时扩增目的DNA。
    • 宿主:真核生物通常有酵母,原核有大肠杆菌等。

    部分载体具有多克隆位点:即包含多个限制性酶切位点,他们是外源基因的插入部位,通过多克隆位点可以实现多种不同的DNA重组,如可以同时获得多种抗性。

    蓝白斑筛选:DNA重组并得以在宿主内表达的菌落呈白色,而非转化的菌落呈蓝色。

    细菌转化:将外源的DNA分子和载体进行重组后,需要将其送到宿主内,通常如大肠杆菌等对重组后的DNA吸收能力差,需要使用如氯化钙处理,才能够较好的吸收这些重组DNA,使其在宿主细胞内表达。

    经过Cohen和Boyer等人的研究发现:某些高等生物如非洲爪蟾的基因,也可以通过DNA重组技术移到原核细胞(如大肠杆菌)中,并能够成功表达。

    DNA基本操作技术

    核酸凝胶电泳

    由于DNA链的多核苷酸呈阴离子状态,放在电场中,会向正极移动,移动的距离和构成DNA的核苷酸的数量相关(因为每个核苷酸带的电量基本是相同的),由于其带的电荷量以及分子大小的不同,在电泳中迁移的速率不同,迁移的距离也不同,故能够分离DNA片段。

    通常凝胶对DNA片段的分辨能力与浓度有关。相同类型的凝胶,浓度越高,截止的空隙越小,对DNA分子的分布能力越强,就可以分离更小尺寸的DNA片段。反之,浓度越大,只能分离长度较大的片段。

    对于超大DNA片段(>50kb),普通的琼脂糖凝胶电泳很难分离,因此发明了脉冲电场凝胶电泳。

    PCR(聚合酶链式反应技术)

    PCR是体外快速扩增待定基因或DNA序列的常用方法,具体步骤如下:

    • DNA在体外摄氏95°高温时变性变成单链(变性)
    • 低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合(复性)
    • 调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。(延伸)

    基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。

    PCR反应五要素:引物(PCR引物为DNA片段,细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)、模板DNA和缓冲液(其中需要Mg2+)。

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