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电转染参数优化

电转染参数优化

作者: 实验小助手 | 来源:发表于2024-02-22 09:30 被阅读0次

电转染是利用直流电脉冲瞬时电击细胞,以增大细胞膜通透性或使细胞膜形成小孔,从而使小分子物质,如染料、寡核苷酸、肽等物质进入细胞。有时甚至可以转染大分子物质,如DNA、RNA、蛋白质等。

电转染有效率高、费时少、成本低等特点,故被广泛采用。但是电击过量所造成的细胞死亡或是电击不足所造成的转染失败,成为该项技术应用的一大难题。所以我们在进行电转染实验之前,首先得对转染相关参数进行优化,以使转染效率最大化。

影响电转染效率的因素有:

1.  脉冲波形

2.  电场强度

3.  脉冲时间

4.  脉冲次数

5.  电击缓冲液

6.  DNA/RNA浓度

下面我们将详细讨论这六个因素对电转染效率的影响。

1.脉冲波形

脉冲波形主要分为两种:1、方波脉冲;2、指数递减波脉冲。

方波脉冲:电压瞬间升至预设电压,保持电压放电,然后瞬间终止放电。

一般哺乳动物细胞电转染时选择方波脉冲,有较高的转染效率和细胞存活率。

指数递减波脉冲:先对电容充电,然后让电容完全放电,其电压变化呈指数递减。一般这种波形的脉冲电转染适用于细菌、酵母菌、昆虫细胞。

2.电场强度

电场是电转染的重要因素,细胞在电场的作用下,膜通透性增加或是形成小孔,以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此,一个适宜的电场强度至关重要。在优化电场强度时应该考虑3个因素:

1) 电击杯电极间距

一般而言电场强度为1-2KV/cm为佳,实验室中大多采用1.25KV/cm。因此如果电极距离为2mm,那么电压应该为:1.25*0.2=0.25KV=250V

2) 细胞直径

一般而言,直径越小的细胞需要越高的电压,而直径越大的细胞需要越小的电压。

3) 温度

大多数哺乳动物细胞可在室温下有效转染。但是高电压、长脉冲时间或是多次脉冲,都会使细胞温度升高,从而加大细胞死亡率,并降低转染效率。因此在低温环境下转染,可降低细胞死亡率、提升转染效率,另外低温环境可延长孔洞开放时间,以使细胞更多地捕获外源分子,如质粒等等。而在某些细胞转染中,低温环境会伤害细胞,降低转染效率。

在4℃环境下转染,应使电压是室温转染的2倍。

3.脉冲时间

脉冲时间的选定主要取决与脉冲波形。在方波脉冲中,脉冲时间可直接设定。在指数递减波脉冲中,脉冲时间是指电压衰减至初始电压1/3时所用的时间,等于电容(C)与电阻(R)的乘积,单位是ms。在参数优化中,增加电压应当降低脉冲时间,而减小电压则应当增大脉冲时间。

4.脉冲次数

一般而言,对于大多数细胞类型都选择单次脉冲。而在有些情况下可能会用到多次脉冲,因为低电压、短脉冲时间、多次脉冲可有效避免细胞损伤。例如,体内电转染时,电压一般设定在10-100V,脉冲时间为30-50μs。

5.电击缓冲液

大多数电击缓冲液采取高电导的电击缓冲液,如PBS、HBSS、标准细胞培养基、血清培养基。有些细胞电转染推荐使用低渗缓冲液,此时应使用更低的电压。细胞在低渗环境中易受伤害,故时间不可太长。

原核细胞需要高电阻的缓冲液,一般大于3000Ω,因此应尽量去除反应体系中的离子,以减少电弧产生从而伤害细胞。

6. DNA/RNA浓度

一般而言,DNA浓度为5-20μg/ml。然而也有例外,比如有些电转染中DNA浓度为50μg/ml能够达到最高转染效率。小分子量的分子转染时(siRNA/miRNA),应使用高电压、短脉冲时间。大分子量分子转染时(DNA),应使用低电压,长脉冲时间。如果Buffer中含有EDTA或是Tris则会降低转染效率。

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