今天要给大家介绍一篇今年3月6日发表在Nature Medicine(IF: 36.130)上的重磅文章，描述的是乳腺癌患者在接受抗PD1治疗期间的瘤内单细胞变化图谱。这篇文章的工作量较大【多图长文预警】，其研究的主要目的是评估派姆单抗(Keytruda或anti-PD1) 是否能够改变早期乳腺癌肿瘤内免疫和增殖相关的生物标志物。
图1. 文章标题
文章背景：
在乳腺癌(BC)的所有亚型中，三阴性乳腺癌(TNBC)具有最高数量的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，这表明TNBC受益于免疫检查点阻断(ICB)。
免疫检查点阻断(ICB)联合新辅助化疗可改善乳腺癌的病理完全应答 (complete response)，然而并非所有BC患者都对新辅助ICB有应答反应。因此目前至关重要的是确定出能够决定治疗应答的潜在机制和相关marker。
TIL评分和PD-L1表达已经被提出用来预测临床结局，但它们作为预测指标的效果仍然不清楚。
研究对象：
两组非转移性、未经治疗的原发浸润性乳腺癌患者队列（如图2所示）。（i）第一组患者在术前9±2天接受了一剂派姆单抗 (Keytruda或anti-PD1) 治疗（ii）第二组患者接受新辅助化疗20-24周，术后使用派姆单抗。在两个队列中，在抗PD1治疗前立即收集肿瘤活检 (标记为“治疗前”)，而在随后的手术中收集另一个活检 (标记为“治疗期间”)。
研究数据：
所有单细胞实验 (scRNA-seq, scTCR-seq和CITE-seq) 的原始测序reads已经保存在欧洲基因组-表型组档案(EGA)中，数据访问号为EGAD00001006608。另外，每个患者的read count可以从http://biokey.lambrechtslab.org公开下载。原始的外显子数据和低覆盖度的全基因组测序实验可以通过EGAS00001004809访问。
图2. 研究方案设计
文章结果：
一、抗PD1治疗前和治疗期间的单细胞分析
（1）使用已建立的scRNA-seq协议，从第一组患者队列中获取了29对治疗前和治疗期间的高质量活检数据，涉及175,942个细胞，平均每个细胞检测到1,759个基因。随后的分析确定了恶性乳腺上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞（如图3b）。恶性细胞簇具有患者特异性，而非恶性细胞簇在患者之间共享。
（2）使用已建立的scTCR-seq协议，在51499个T细胞中定义了基于共享TCR序列的克隆型，共确定了9例在治疗前与治疗期间在两个阈值（>2或>5）上的克隆型扩张患者（如图3c）。
（3）将克隆型频率与T细胞数量标准化后，表现出克隆型扩张的患者定义为克隆型扩张患者“E(s)”，其他患者(n=20)显示有限或无克隆型扩增，定义为“NE(s) ”。
图3. UMAP细胞类型图(b)和扩张克隆数量(c)
二、表达PD1的T细胞在抗PD1治疗后扩增
（1）作者分析了T细胞扩增(E vs NE)和治疗(治疗前vs治疗期间)分层的scRNA-seq数据。发现经过治疗后，NEs中成纤维细胞较多，Es中T细胞较多（如图4d）。在治疗期间，癌细胞和成纤维细胞在NEs中更常见，而T细胞在Es中进一步富集。
（2）通过对T细胞进行亚聚类（如图4e），发现一个CD8 +及CD4 +细胞簇表达PD1（如图4f），表示免疫检查点标志物（LAG3, HAVCR2, PDCD1）、效应(IFNG, NKG7)标志物和细胞毒性标志物 (GZMB, PRF1) 都表达的具有耗竭样的活化T细胞。作者将这种细胞称为经验T细胞（TEX细胞）。作者还检测到第三个由高增殖T细胞组成的PD1+细胞簇。它们的相对丰度在治疗前后都较高，并且在治疗后升高（如图4g）。
（3）增殖T细胞主要由CD8+和CD4+TEX细胞组成，但也有13%为CD4+调节性TREG细胞。作者将将增殖的T细胞分配给它们各自的CD8+TEX、CD4+TEX和TREG亚细胞簇，所得到的CD4+和CD8+TEX细胞亚群在Es中比在NEs中更频繁地出现在经过治疗后的组（如图4h）。
（4）治疗前后相比，Es细胞与NEs细胞的T细胞克隆性和Gini指数均增加，TEX细胞的克隆性最高。相反，治疗前后的Es克隆型丰度都低于NEs（如图4i）。
（5）使用CITE-seq证实了治疗前Es T细胞中PD1的表达增加（如图4j）。
图4. 每种细胞类型的相对贡献(d,h)、T细胞亚群(e)、PD1的表达水平(f,j)、增殖T细胞占比(g)和TCR富集情况(i)
三、T细胞沿着CD8+TEX细胞轨道扩张
（1）使用Slingshot生成伪时间轨迹，观察了三种不同的CD8+ T细胞轨迹（如图5a）。TN连接到TEM细胞，TEM细胞分叉成三种不同的轨迹，形成TEX1和TEX2细胞、滞留记忆CD8+ T细胞(TRM)和激活效应/记忆T细胞(TEMRA细胞)。TCR丰度沿轨迹下降，克隆型通常在随后的T细胞表型之间共享（如图5b）。
（2）RNA速度分析证实了这些轨迹，而标记基因图谱证实了它们的功能注释（如图5c,d）。无论是治疗前还是治疗期间，Es和NEs中TEX细胞更频繁地出现在轨迹末端（如图5e）。
图5. CD8+ T细胞的轨迹分析
四、T细胞沿着CD4+TH1和TFH细胞的轨迹扩张
（1）在CD4+ T细胞(TREG除外)中，Slingshot发现了额外的表型异质性。经验丰富的TEX细胞分裂为1型辅助细胞(TH1)和滤泡辅助细胞(TFH)（如图6f）。虽然免疫检查点标记物(PDCD1, CTLA4)在TH1和TFH细胞中均高表达，但它们在TH1- (IFNG, GZMB)和TFH特异性标记物(BCL6, CXCR5)的表达存在差异。
（2）Slingshot发现了一个从TN1细胞开始，向TN2细胞发展的轨迹，接着是TEM1 − 3细胞，然后分裂成有关TH1或TFH细胞的轨迹。后续表型之间的克隆型共享最高，而RNA速度独立证实了这些轨迹（如图6g,h）。
（3）沿轨迹的标记基因和相关转录因子图谱证实了它们的功能注释（如图6i）。无论是治疗前还是治疗期间，NEs中的TH1和TFH细胞仍然处于早期的前效应/记忆状态（如图6j）。TH1和TFH轨迹在很大程度上促进了克隆型扩增，表明它们支持CD8+TEX细胞的持续效应功能。
图6. CD4+ T细胞的轨迹分析
五、T细胞扩张过程中基因表达的变化
（1）发现了五组沿着CD8+TEX轨迹的差异表达基因(DEGs)。一组由幼稚T细胞标记物(CCR7, LEF1)组成的第一组沿着轨道下降，而两组由(早期)激活基因(GZMK, GZMM, GZMA, NKG7)组成的第二组在轨道中间上升，但随后下降。另外两组在接近轨道末端时呈上升趋势，表现为效应因子(IFNG)、细胞毒性(GZMB、PRF1)、早期和一般衰竭(PDCD1、CTLA4、ENTPD1)（如图7a）。
（2）虽然轨迹分配的细胞在相同的伪时间点具有相似的表达，我们观察到一些基因在E和NE轨迹之间有差异表达。例如，效应基因和细胞毒性活性相关基因(PRF1、GZMB、IFNG)、CTLA4和TOX2在Es中始终较高（如图7b）。
（3）通路分析显示Es中干扰素(IFN)反应上调，氧化磷酸化下调（如图7c,d）。
（4）在比较Es和NEs(补充数据集4)时，沿着CD4+ TH1的轨迹，我们同样鉴定了5个基因集(如图7e)和499个DEGs，包括潜在的TH1标记物，如ZEB2（如图7f）。与CD8+ T细胞相似，NEs中RUNX3和CBFB减少，而Es中IFN-α/γ反应增加（如图7f-h）。因此，沿着轨迹的基因表达谱可以确定Es和NEs之间差异表达或激活的标记或通路。
图7. CD8+TEX轨迹中的差异表达基因
图8. CD4+TH1轨迹中的差异表达基因
六、T细胞的表达特征预测T细胞的扩张
（1）鉴定了治疗前扩张的T细胞与不扩张的T细胞之间的DEGs（如图8a）。非扩张的T细胞更幼稚(LEF1, SELL, TCF7)，而扩张的T细胞表现出高效应功能(IFNG)，免疫细胞归巢信号(CXCL13, CCL3/4/5)，细胞毒性(GZMB, PRF1, NKG7)，抗原递呈(CD74, HLA-DRB1/5, HLA-DQA2)和免疫检查点标记物表达(PDCD1, HAVCR2, LAG3)。
（2）治疗前免疫检查点标记物和CD4+TH1活性在Es和NEs中最能预测T细胞扩张(CD8+细胞毒性和IFN-γ活性的AUC= 0.93-0.96 vs 0.70-0.87; 如图8b)。
（3）CITE-seq证实NEs中幼稚T细胞标记物高于Es，而免疫检查点、肿瘤反应和共刺激标记物减少（如图8c）。
（4）当Es、TNBC (n=5)与ER+ BC (n=3)比较时，扩张的克隆类型数目没有差异。然而，治疗后的T细胞中PD1的表达和扩张T细胞的数量在TNBC中更高（如图8d,e）。在治疗前的TNBC中，Es也表现出CD8+ T细胞效应功能基因表达增加、CD4+TH1活性和免疫检查点基因增加（如图9f）。
图9.1 扩张T细胞和非扩张T细胞的比较
七、新辅助化疗及抗PD1后的T细胞扩张
（1）通过分析抗PD1治疗前接受新辅助化疗的患者 (n=11) 的治疗前和治疗期间活检(队列2)，发现在Es中，T细胞和pDCs只在治疗后增加，而PD1在治疗前后均增加（如图9h,i）
（2）T细胞亚聚类证实了无论是治疗前还是治疗后，Es中CD4+和CD8+TEX细胞更常见（如图9j）
图9.2 扩张T细胞和非扩张T细胞的比较
八、树突状细胞与T细胞扩增相关
（1）作者对仅接受抗PD1治疗的患者(n=29)的2410个DCs进行亚聚类分析，揭示了6种表型（如图10a）；
（2）与NEs相比，Es致DC中PD-L1 (CD274)和PD-L2 (PDCD1LG2)升高（如图10b）；
（3）免疫组化证实了治疗前和治疗期间Es的PD-L1均较高（如图10c）；
（4）在DC亚型中，PD-L1仅由mregDCs表达（如图10d）；
（5）治疗前的相对DC频率在Es和NEs之间没有差异，除了mregDCs在Es中富集（如图10e）；
（6）治疗前Es和NEs的DEGs显示出干扰素响应、DC分化、抗原交叉呈递和T细胞共刺激相关基因水平的升高（如图10f）；
图10. 表达PD-L1的树突状细胞与T细胞扩张有关
九、表达PD-L1/L2的巨噬细胞与T细胞扩增相关
（1）作者将7952个髓系细胞分为10个表型，包括两个单核细胞群(C1和C2)和八个巨噬细胞群 (C3-C10) (如图11h)。与树突状细胞相似，巨噬细胞也表达PD-L1和PD-L2，不过表达的丰度更高；
（2）在治疗前的巨噬细胞中，Es中PD-L1/L2明显高于NEs，而一些细胞因子(CXCL9、CXCL10、CCL8)和I/II型IFN应答基因上调 (如图11i)；
（3）CITE-seq证实Es与NEs治疗前共刺激标记物的表达增加 (如图11j)；
（4）在细胞亚群水平，大多数巨噬细胞表型表达PD-L1（如图11k）；
（5）在Es治疗前，C7_CX3CR1巨噬细胞处于耗竭状态，并在治疗后变得更加明显，而治疗期间C3_CCR2巨噬细胞(基于M1标记物表达的促炎巨噬细胞(CXCL9/10, SOCS3))在Es富集（如图11l）。
图11. 表达PD-L1的巨噬细胞与T细胞扩张有关
十、在T细胞扩张的肿瘤中，抗PD1对癌细胞的影响
（1）与治疗前相比，治疗期间Es的癌细胞数量减少了（如图12a）；
（2）虽然作者未能在癌细胞中检测到PD-L1，但发现了许多抗原呈递主要组织相容性复合体(MHC) I/II类基因在NEs和Es中通过scRNA-seq和CITE-seq下调（如图12b,c）；
（3）比较Es治疗前和治疗后，证实了正在进行的抗肿瘤免疫反应，细胞增殖、蛋白水解、细胞死亡、免疫信号通路和细胞毒性通路富集于Es治疗后的癌细胞中（如图12d）；
图12. T细胞扩张的肿瘤在治疗前后的比较
十一、与T细胞扩张相关的免疫环境
（1）CD4+或CD8+TEX细胞、增殖T细胞、migDCs、表达PD-L1的巨噬细胞表型(包括CCR2+和MMP9+巨噬细胞)的相对频率与T细胞的扩张呈正相关，而幼稚或效应/记忆T细胞与抑制性 (CX3CR1+) 巨噬细胞呈负相关（如图13e）；
（2）作者使用CellphoneDB预测了受体与配体的相互作用，观察到，治疗前Es比NEs有更多的相互作用可能性，特别是在癌细胞、DCs、单核/巨噬细胞和T细胞之间（如图13f）。Es中CD8+或CD4+ T细胞与其他免疫细胞之间的特异性相互作用，包括共刺激(CD28-CD80, ICOS-ICOSLG)或共抑制(PDCD1-CD274/PDCD1LG2 (PD1-PD-L1/2)、HAVCR2-LGALS9 (TIM3-Galectin9)、CTLA4-CD80/CD86)相互作用（如图13g,h）
图13. 交互免疫环境与T细胞扩张正相关
文章小结
这篇文章评估了接受ICB的乳腺癌患者的肿瘤内变化。分析的是来自配对的治疗前（接受抗PD1治疗的29名初诊患者）和治疗期间（抗PD1治疗前接受新辅助化疗的11名患者）的单细胞转录组、T细胞受体和蛋白质组数据。发现三分之一的肿瘤含有表达PD1的T细胞，不论肿瘤亚型如何，抗PD1治疗后T细胞可克隆扩张。在治疗前的活检中，免疫调节树突状细胞(PD-L1+)、特异性巨噬细胞表型(CCR2+或MMP9+)和主要组织相容性复合体I/II类表达的癌细胞的相对频率与T细胞的扩张呈正相关。相反，未分化前效应/记忆T细胞(TCF7+， GZMK+)或抑制性巨噬细胞(CX3CR1+，C3+)与T细胞扩张呈负相关。总的来说，文章的数据确定了各种免疫表型和相关基因集，它们与抗PD1治疗后的T细胞扩张呈正相关或负相关，揭示了乳腺癌中抗PD1治疗反应的异质性。
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