主要器材和试剂
| 实验材料 | 细胞样品 冰冻或新鲜组织 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | TRIzol试剂 氯仿 异丙醇 75%乙醇 DEPC H2O |
| 仪器、耗材 | 离心管 离心机 |
1 总RNA提取
- 样品处理：
- 培养细胞：收获细胞1-5×10^7，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。
- 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。
- 加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。
- 4℃离心，12000g×15min，取上清。
- 加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
- 4℃离心，12000g×10min，弃上清。
- 加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。
- 点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10 min， DEPC处理水40μl加入，中枪打匀，55-60 ℃水浴10 min溶解总RNA，测OD值。
2.从总RNA中分离mRNA
1、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 μl。
2、加入Buffer OBB 250 μl, Oligotex Suspension 15 μl。用Tip打匀或用手弹匀。
3、70℃水浴，3 min（裂解RNA的二级结构）。
4、20-30℃条件下，静置10 min（让Oligotex与mRNA结合）。
5、高速离心2 min，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50 μl的上清在原管里。
6、用Buffer OW2 400 μl重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1 min。
7、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400 μl到柱子，高速离心1 min，丢掉滤过液。
8、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100 μl热的（70 ℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4 次，高速离心1 min。
9、为保证最大的 mRNA产量，可再次重复第8步。
10、电泳。
注意事项
- 样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。
- 实验过程必须严格防止RNsae的污染。
3. 样品cDNA合成
(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)), Takara反应体系。
反转录反应：TB Green qPCR分析法，这里以takara为例。
1. 去除基因组DNA反应
按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。
| 试剂 | 使用量 |
|---|---|
| 5×gDNA Eraser Buffer | 2.0 μl |
| gDNA Eraser | 1.0 μl |
| Total RNA | *1 |
| RNase Free dH2O | up to 10 μ |
↓
42℃ 2 min（或者室温5 min*2）
4℃
2. 反转录反应
反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装10 μl到每个反应管中*3。轻柔混匀后立即进行反转录反应。
| 序号 | 试剂 | 使用量 |
|---|---|---|
| 1 | 步骤1的反应液 | 10.0 μl |
| 2 | PrimeScript RT Enzyme Mix I | 1.0 μl |
| 3 | RT Primer Mix *4 | 1.0 μl |
| 4 | 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） | 4.0 μl |
| 5 | RNase Free dH2O | 4.0 μl |
| 6 | Total | 20 μl *5 |
↓
37℃ 15 min6
85℃ 5 sec
4℃7
Master Mix(10 μl) = 2 + 3 + 4 + 5
附注：
*1: 20 μl反转录反应体系中，TB Green qPCR法最多可使用1 μg的Total RNA，探针qPCR分析法最多可使用2 μg的Total RNA。
*2: 室温反应时，可以延长至30分钟。
*3: 若不配制Master Mix，向步骤1的反应液中添加试剂时，要先加入RNase Free dd2O和5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time)混合均匀，以使gDNA Eraser的活性充分受到抑制， 再添加RT Primer Mix、PrimeScript RT Enzyme Mix I，轻轻混匀进行反转录反应。
*4: 使用RT Primer Mix可以高效合成cDNA。因为实验目的不同，也可以不使用RT Primer Mix，而选择Oligo dT Primer或Gene Specific Primer进行反转录反应，引物使用量如下：
- Oligo dT Primer 50 pmol／20 μl反应体系
- Gene Specific Primer 5 pmol／20 μl反应体系
*5: 反转录体系可以根据需要相应扩大。
*6: 使用Gene Specific Primer时，建议反转录反应条件设置为42℃ 15 min。PCR反应有非特异性扩增时，将温度升到50℃会有所改善。
*7: 合成的cDNA需要长期保存时，请于-20℃或更低温度保存。
注意:
- 在反转录反应中，TB Green qPCR法的RT Primer Mix 用量为1 μl，探针qPCR分析法的用量为4 μl。
- 得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10（V/V）量。
4. qPCR
【使用 Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System 和 StepOnePlus Real-TimePCR System 时的操作方法】
※请按照各仪器的使用说明书进行操作。
1. 按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行）。
1 反应体系
| 试剂 | 使用量 | 使用量 | 终浓度 |
|---|---|---|---|
| TB Green Fast qPCR Mix（2×） | 10 μl | 25 μl | 1× |
| PCR Forward Primer（10 μM） | 0.8 μl | 2 μl | 0.4 μM |
| PCR Reverse Primer（10 μM） | 0.8 μl | 2 μl | 0.4 μM |
| ROX Ref. Dye or Dye II（50×） |
0.4 μl | 1 μl | 1× |
| DNA 模板 |
2 μl | 4 μl | |
| 灭菌水 | 6 μl | 16 μl | |
| Total | 20 μl |
50 μl |
*1：通常引物终浓度为 0.4 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.2～1.0 μM
范围内调整引物浓度。
*2：ROX Reference Dye II（50×）比 ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用 Applied
Biosystems 7500 Real-Time PCR System 和 7500 Fast Real-Time PCR System
时，请使用 ROX Reference Dye II（50×）。
使用 StepOnePlus 和 7300 Real-Time PCR System 时，请使用 ROX Reference Dye
（50×）。
*3：模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。在 20 μl 反应体系中模板 DNA 添加量最好在 100 ng 以下。以 RT-PCR反应的 cDNA（RT 反应液）为模板时，添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%
*4：按照各仪器推荐体系进行反应液配制。
2. 开始 Real Time PCR 反应。
建议采用下面的 Shuttle PCR 标准操作流程进行 PCR 反应。
首先尝试使用下面的操作流程，必要时进行 PCR 反应条件的优化。使用 Tm 值较低的引物等进行
Shuttle PCR 难以扩增时，进行三步法 PCR 扩增反应。优化 PCR 反应条件请参照「实验条件的选择方法」。
<Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus>
Shuttle PCR 扩增标准操作流程：
Stage 1：预变性
Reps：1
95℃ 30 秒
|>>>>>>
Stage 2：PCR 反应
Reps：40
95℃ 5 秒
|>>>>>>>>>>>>>>
60℃ 10～15 秒*
|>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>|
Stage 3：Melt Curve
*：选择所使用的荧光通道（FAM、ROX），通过选择的荧光通道可以设定最短的检测时间。
StepOnePlus 可以设定为 10 秒。
<Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System>
Shuttle PCR 扩增标准操作流程：
Holding Stage
Reps：1
95℃ 30 秒
|>>>>>
Cycling Stage
Number of Cycles：40
95℃ 3 秒
60℃ 12 秒～15 秒＊
|>>>>>>>>>>>>
Melt Curve Stage
|>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>|
*：选择所使用的荧光通道（FAM、ROX），通过选择的荧光通道可以设定最短的检测时间
※使用注意：
本制品中使用的突变型 Taq HS 是利用抗 Taq 抗体抑制 DNA 聚合酶活性的 Hot Start PCR 酶。与其
他公司的化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的
活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量准确度等都会受
到影响。如果在 PCR 反应前进行模板的预变性，通常设定为 95℃、30 秒。
3. 反应结束后确认 Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线。
分析方法参见 Real Time PCR 仪的使用说明书。
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