RF6 PPR蛋白与OsHXK6互作恢复水稻CMS

Title：Pentatricopeptide-repeat family protein RF6 functions with hexokinase 6 to rescue rice cytoplasmic male sterility

Lab：朱英国

Year：2015

Journal: PNAS

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目录：
[TOC]

背景

CMS	MitoGene	Rf-Gene	AbortionStage
WA	WA352	Rf3, Rf4	unicucleate单核
BT	atp6-orf79	Rf1A, Rf1B	trinucleate三核
HL	atp6-orfH79	Rf5, Rf6	dinucleate双核

• HL-CMS：不育表现为双核期花粉球形，不能被I₂-KI染色。orfH79是造成不育性状的线粒体异常基因，位于atp6下游。ORFH79与P61（线粒体复合物III的亚族）结合后引发复合物活性降低，进一步导致线粒体内能量代谢功能失调，氧化胁迫增强，最终导致花粉败育^[1][2][3][4]。

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Abstract

💡图位克隆了Rf6基因，该基因编码一个新型PPR蛋白，包含PPR特异性元件motifs 3-5.
💡RF6在线粒体中与OsHXK6结合，并降低了CMS atp6-orfH79的积累。从而保证了花粉的正常发育，恢复水稻育性。
💡这是一种恢复CMS育性的新机制(PPR蛋白与己糖激酶互作）。
💡还发现了OsHXK6可能参与线粒体内的RNA代谢，这可能为水稻杂种优势的研究提供便利。

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Results

1. Rf6基因的克隆和鉴定

map-based cloning：
putitive genes：AK066315 and AK068841

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• 互补试验
  vevtor with Orf1 or Orf2 transformed into YTA sterile line for complementation analyses.
  T0 plants: containing Orf2 display normal fertility.
  

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• 小结：Rf6基因是AK068841

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2. Rf6的表达情况

• ==表达在细胞的哪个部位？==
  GFP-fused RF6 protein：35S:GFP:nos(CK) and 35S:Rf6-GFP:nos(Rf6) in rice protoplasts.
  

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• 小结：Rf6基因表达在线粒体上

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3. Rf6与rf6有何不同？

Rf6编码一个新的PPR蛋白，894氨基酸，20个PPR motifs(PPR motifs3-5有一个重复区段，这3个motifs在*rf6*及其他已知RF蛋白中缺失)。

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除了motif3-5，Rf6和rf6其他区段的序列都很similar.
truncated Rf6 genes: a series of ones: Rf6L-1-9 transformed to YTA

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motif3 is essential and sufficient for Rf6
RF6晶体模型：crystal structure

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interaction interface：motifs 3-5重复区段形成loosely extended结构，可能是为蛋白-蛋白结合提供结合区域。

其他水稻品种中有motif3-5吗？
系统发育树分析：Rf6，motif3-5存在于多个籼稻品种中以及少数的野生稻中。推测RF6中的motif3-5来源于野生稻中的一个片段复制事件。

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• 小结：Rf6上重复的motifs3-5对恢复育性是必须的

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4. RF6蛋白的功能是啥？

• HL-CMS不育是因为ORFH79蛋白的存在

• ==RF5 恢复HL-CMS的机理==
  RF5与辅因子(cofactor)GRP162结合，将atp6-orfH79转录本裂解为两部分atp6和orfH79，干扰ORFH79蛋白的合成。

• ==RF6是否和RF5的功能相同？==
  primer extension assay：可能是RNA加工因子切断了atp6-orfH79, 加工的位点位于atp6-orfH79单链1238bp处。这与RF5不同，RF5的加工位点是atp6-orfH79单链1169bp处。RF5与RF6对atp6-orfH79 的RNA加工机制不同**。
  

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• 小结：RF6导致atp6-orfH79 RNA被切断，从而恢复育性，但加工位点和RF5不同

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5. RF6究竟是如何加工atp6-orfH79 RNA的？

• RF6不与atp6-orfH79 RNA结合。**
  

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• ==RF6是否和RF5一样，结合GRP162?==
  YEAST two-hybrid assay: no signs
  

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  RF6不与RNA加工因子 GRP162结合。

• ==RF6的合作伙伴到底是谁？==
  yeast two-hybrid library：RF6 as bait identified 10 genes.
  

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  OsHXK6, 定位于核和线粒体，表达谱与RF6非常接近：
  

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  yeast two-hybrid library：OsHXK6与RF6结合，不与rf6结合：
  

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  pull-down assay：
  GST-OsHXK6 与MBP-RF6结合，不与MBP-rf6结合
  

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  coimmunoprecipitation assay：in vivo Myc-tagged RF6 与OsHXK6结合
  

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• 小结：RF6不与atp6-orfH79 直接结合，也不与GRP162结合，而是与OsHXK6结合

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6. RF6哪个区段与OsHXK6结合，真的是猜想的motif3-5吗？

yeast two-hibrid assay:惊人地发现：OsHXK6与RF6的C端结合，而不是motif3-5所在的N端。推测motifs3-5的功能可能是建立合适的分子构造，而不是提供结合位点。

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• 小结：与OsHXK6结合的不是RF6的motifs3-5，而是C端

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7. OsHXK6作为一个激酶，哪个区域与RF6结合？

yeast two-hybrid assay:检测RF6与不同truncated OsHXK6的结合情况。RF6不与酶活N端发生结合，而是与C端结合。

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8. OsHXK6到底是怎么帮助RF6对atp6-orfH79 RNA进行加工的？

• RNA interference:
  抑制OsHXK6基因在R-7(Rf6Rf6)表达。所得的转基因植株OsHXK6i的OsHXK6表达水平降低：
  

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  OsHXK6i植株的atp6-orfH79 RNA出现积累
  OsHXK6i植株的ORFH79蛋白也出现积累：
  

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  OsHXK6i植株的花粉出现50%不育：
  

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  OsHXK6i植株的Rf6表达水平并没有被影响
  

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  • 小结：OsHXK6与RF6结合后，对atp6-orfH79进行RNA 加工，OsHXK6并不能调控RF6的表达水平

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讨论

1.可能的模型

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2.PPR家族

• ❓==RF6的特异性重复区段motifs3-5 到底有什么功能==？
  可能是提供合适的分子构造，也可能是与未知的mediator蛋白结合。
• ❓==在不同的CMS系统中，Rf5可以结合RNA, 也可以结合蛋白？==

3. OsHXK6

OsHXK6是己糖激酶family的成员，水稻中的己糖激酶family由10个成员组成。
相对而言，OsHXK6在线粒体中的功能还是未知。而这次发现OsHXK6作为RF6的伙伴，共同参与线粒体RNA转录加工。而其糖激酶活性区域并未直接与RF6结合，这可能表明OsHXK6对育性恢复的作用是独立于其糖敏功能。
虽然RF5和OsHXK6都对RNA atp6-orf79的加工必不可少，但它们都不能直接结合RNA:

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这说明，结合RNA还存在其他蛋白，用于结合和剪切RNA。

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1. Yi P, Wang L, Sun Q, Zhu YG (2002) Discovery of mitochondrial chimeric gene associated with male sterility of HL-rice. Chin Sci Bull 47(9):744–747. ↩

2. Peng X, et al. (2010) The mitochondrial gene orfH79 plays a critical role in impairing both male gametophyte development and root growth in CMS-Honglian rice. BMC Plant Biol 10:125. ↩

3. Liu G, et al. (2012) Alterations of mitochondrial protein assembly and jasmonic acid biosynthesis pathway in Honglian (HL)-type cytoplasmic male sterility rice. J Biol Chem 287(47):40051–40060. ↩

4. Wang K, et al. (2013) ORFH79 impairs mitochondrial function via interaction with a subunit of electron transport chain complex III in Honglian cytoplasmic male sterile rice. New Phytol 198(2):408–418. ↩